이때 사용하는 항체는 찾고자 하는 항원(단백질)에 대해 특이하게 반응하는 것을 방사성 동위원소로 표식하여 사용하거나 또는 특정 효소(예: alkaline phosphatase, horseradish peroxidase 등) 또는 형광을 나타내는 색소(예: FITC: fluorescein isothiocyanate)를 결합시킨 것을 이용함으로서 찾고자 하는 적은 양의 단백질을 가시화할 수 있다.

본 장에서는 백서간장내 세포질에 존재하는 효소인 ATP-citrate lyase(ACL)를 western blot 기법으로 분석하는 실험으로서 alkaline phosphatase가 결합된 항체를 사용하여 발색시키는 방법을 소개한다. Alkaline phsphatase에 의하여 촉매되는 반응은 3-bromo-4-chloro-5-indolyl phosphate(BCIP)와 nitrobluetetrazolium(NBT) 사이에서 일어난다.

A. Western transfer

실험방법

* 실험재료
Transfer 완충용액 (25 mM Tris-Cl, pH 8.3, 1.4% glycine, 20% methanol)
TBST 완충용액 (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20)

1. 전기영동이 끝난 gel을 약 50 ml의 transfer 용액으로 30분간 평형시킨다. Nylon membrane(혹은 nitrocellulose)도 적당한 크기로 자른 후 gel과 마찬가지로 완충용액에 담가 30분간 평형시킨다.

* Nitrocellulose membrane을 사용하는 경우 완충용액에 담그기 전에 증류수에 먼저 한쪽 끝부터 서서히 전체 membrane을 적신 후 완충용액에 담근다.

2. Western blot용 cassette를 transfer 완충용액이 담긴 용기에 놓고 그 위에 transfer 완충용액에 적신 dacron sponge와 Whatman 3MM 여과지 2매를 올려 놓는다.

3. Transfer 완충용액으로 평형시킨 gel을 기포가 생기지 않도록 조심스럽게 Whatman 3MM 여과지 위에 올려 놓는다.

4. Gel 위에 transfer 완충용액으로 평형시킨 membrane을 기포가 생기지 않도록 조심스럽게 놓고 그 위에 여과지를 2매와 dacron sponge를 올려 놓는다.

5. Cassette를 기포가 생기지 않도록 조심스럽게 고정 장치한 후 양쪽 cassette가 떨어지지 않도록 clip을 조인다.

6. 장치된 cassette를 blotting chamber에 옮긴 후 cassette내의 membrane이 충분히 잠기도록 표시된 부분까지 transfer 완충용액을 넣고 membrane 쪽이 양극, gel 쪽이 음극이 되도록 전극을 장치한 다음 200 mA로 4°C에서 4시간 동안 transfer한다.

* 단백질의 크기가 클수록 transfer에 필요한 시간이 길어진다. 분자량이 큰 단백질의 transfer를 위해 전류의 크기를 500 mA까지 증가시킬 수도 있고 transfer 시간을 길게 할 수도 있다.

7. Transfer가 끝난 후 membrane을 건조된 여과지에 옮겨 상온에서 건조시킨 다음 4°C에 보관해 두거나 곧바로 면역염색법을 시행한다.

B. 면역염색법(Immunostaining)

실험방법

* 실험재료
ACL에 대한 항혈청 (TBST 용액으로 적당히 희석한 후 사용)
Anti-rabbit IgG-alkaline phosphatase conjugate
Alkaline phosphatase 기질 용액: NBT를 70% dimethylformamide에 50 mg/ml로 용해시켜 NBT 용액을 만들고, BCIP를 100% formamide에 50 mg/ml로 용해시켜 BCIP 용액을 만든 후 alkaline phosphatase 반응완충용액(100 mM Tris-Cl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 M magnesium chloride) 10 ml에 NBT 용액 66 μl와 BCIP 용액 33 μl를 혼합하여 기질 용액으로 사용한다.

1. 단백질이 transfer된 membrane을 1% bovine serum albumin이 포함된 TBST 용액에 담가 흔들어주면서 1시간동안 실온에서 방치하여 membrane에 단백질이 결합하지 않은 부분을 blocking시킨다.

* 1% BSA 대신 5% 탈지분유(non-fat dried milk)를 사용할 수도 있다.

2. Blocking을 위해 사용된 완충용액을 제거하고 TBST 용액으로 membrane을 3회에 걸쳐 10분씩 세척한다.

3. TBST 완충용액을 이용하여 적당한 농도로 희석시킨 ATP-citrate lyase에 대한 항혈청 희석용액을 membrane이 충분히 잠길만큼 가하여 4°C에서 한시간 두어 membrane에 transfer된 ATP-citrate lyase의 단백질에 결합하도록 한다.

4. 항혈청 희석 용액을 제거한 후 TBST 용액으로 membrane을 3회에 걸쳐 10분씩 세척한다.

5. TBST 용액으로 적당히 희석시킨 goat anti-rabbot IgG-alkaline phosphatase를 30분간 실온에서 반응시킨다.

* 항원-항체 반응이 일어난 것을 눈으로 확인하기 위해 일차항체(primary antibody)와 결합하는 이차항체(secondary antibody)로 goat anti-rabbot IgG-alkaline phosphatase를 반응시킨 것이다.

6. Goat anti-rabbot IgG-alkaline phosphatase 용액을 제거한 후 TBST 용액으로 membrane을 3회에 걸쳐 10분씩 세척한다.

7. Membrane이 잠길만큼 적당한 양의 alkaline phosphatase 기질용액을 첨가한 후 서서히 흔들면서 반응시켜 원하는 단백질대(band)가 나타나는지 관찰한다.

8. 원하는 단백질대가 선명히 나타나면 10 mM EDTA 용액으로 세척하여 반응을 중지시킨다.

9. Membrane을 보관해 두면 반응색이 변하는 수가 있으므로 사진을 찍어 보관한다.