이 방법을 응용하여 RNA를 분석하는 Northern blot, 단백질을 분석하는 Western blot이 개발되었고, 원리는 크게 다르지 않다. 이들의 분석을 위한 실험과정의 예를 들면 다음과 같다.

1) 시료 준비: 조직이나 세포로부터 DNA, RNA, 단백질을 분리한다.

2) 전기영동: 시료에 따라 일반적으로 사용되는 전기영동 방법은 다음과 같다.
DNA : agarose gel 전기영동
RNA : formaldehyde를 첨가한 agarose gel 전기영동
단백질 : SDS-polyacrylamide gel 전기영동

3) Transfer: 전기영동한 gel은 깨지기 쉬워 다루기 어려우므로 solid support에 옮긴 후 분석 과정을 시행한다. 이 때 solid support에 옮기기 위해 주로 사용되는 방법은 다음과 같다.
DNA : Capillary transfer, Vacuum transfer
RNA : Capillary transfer, Vacuum transfer
단백질 : Electrotransfer

4) 분석: Solid support에 옮겨진 시료를 분석하기 위해 일반적으로 사용하는 방법은 다음과 같다.
RNA, DNA: Hybridization(with probe DNA or RNA)
단백질: 면역검색법(immunostaining) (with antibody)

* 서로 기원이 다른 DNA-DNA 또는 RNA-RNA가 결합된 상태를 hybrid라 하고 이를 이용하여 실험하는 방법을 hybridization이라 한다. Solid support에 붙은 DNA 또는 RNA 시료를 변성시킨 후 방사성 동위원소가 표지된 탐침자(probe)로 이용할 nucleotide를 결합시키면 원하는 시료의 존재여부를 판정할 수 있게 된다. 이와 다르게 Western blot에서는 antigen-antibody 결합을 이용한다.

Agarose gel로부터 solid support로 DNA의 이동 방법

1) 모세관 현상을 이용한 이동(Capillary transfer)

흔히 Southern blot 혹은 Southern hybridization 이라 불리우는 방법으로 Southern(1975)에 의해 고안되었다. Agarose gel 내에서 크기별로 분류된 DNA 조각들이 모세관 현상에 의한 용액의 흐름을 타고 유출되어 solid support의 표면에 축적되도록 하는 방법이다. 모세관 현상은 다음 그림에서와 같이 여러겹의 종이 흡수지를 타고 용액이 흐르게 되어 형성되게 된다.

이때 DNA의 이동효율은 DNA 조각의 크기와 agarose gel의 농도에 따라 변하게 된다. 1 kb 이하의 작은 크기의 DNA는 0.7% gel로부터 약 1시간 이내에 쉽게 이동된다. 그러나 더 큰 크기의 DNA의 이동은 이동속도가 늦고 그 효율도 떨어지게 된다. 예를 들어 15 kb 이상의 DNA를 모세관 현상을 이용하여 이동시키기 위해서는 18시간 이상의 시간이 필요하며 그나마 완전히 이루어지지는 않는다. 이런 큰 크기의 DNA 이동은 gel이 탈수되기 전에 얼마나 gel로부터 유출되는냐에 따라 결정되는데, 그것은 이동 과정중에 용액이 reservoir로부터 흐르기도 하지만 gel 자체에 있던 용액이 흘러나와 탈수되면 gel은 더욱 농도가 높아지고 단단해져서 DNA가 유출되는 것이 불가능해지기 때문이다. 이런 문제는 DNA를 이동시키기 전에 부분적으로 가수분해 시킴으로써 감소시킬 수 있다. 또한 그림에서 보는 무게 추를 지나치게 무거운 것을 놓아도 동일한 부작용이 있으므로 약 500 g 이상을 놓지 않도록 한다.

DNA를 약산에 노출시키게 되면 부분적으로 depurination 현상이 일어나게 되며 다시 염기에 노출시키면 변성된 곳의 phosphodiester 결합의 DNA 골격이 가수분해 된다. 그 결과 DNA 조각의 크기가 1kb 정도로 되므로 gel로부터 쉽게 유출되어 이동시킬 수 있다. 그러나 이런 반응이 과다하게 일어나게 되어 너무 작은 크기로 DNA가 조각나게 되면 solid support에 결합이 어려워지므로 유의하여야 한다. 또한 변성과 가수분해의 결과 자가방사법상 나타나는 band가 날카롭지 못하고 퍼지는 양상을 보일 수도 있다. 이는 DNA의 이동중에 DNA의 확산(diffusion)이 일어나기 때문으로 생각된다.

2) 전기장을 이용한 이동(Electrophoretic transfer)

이 방법은 전기장을 이용하여 gel로부터 DNA를 유출시켜 solid support로 이동시키는 방법이다. 그러나 이 경우 핵산을 filter에 결합시킬 때 필요한 완충용액의 이온강도(ionic strength)가 매우 높기 때문에 nitrocellulose를 solid support로 사용할 경우에는 부적합하다. 또한 사용되는 완충용액은 전류를 효과적으로 흐르게 하여야 하므로 실험중 전해질에 의한 완충작용의 소실을 방지하기 위해 충분한 용량을 사용하여야 한다. 또, 전기장에 의한 과열 방지를 위한 냉각작용을 하는 장치가 필요하다. 그러므로, diazobenzyloxymethyl(DBM) 혹은 o-aminorhenylthioether(ART)-cellulose와 같이 낮은 이온강도에서 핵산과 효과적으로 결합하는 support에 한하여 사용된다.

3) 진공을 이용한 이동(Vacuum transfer)

DNA나 RNA는 진공을 이용하여 gel로부터 매우 신속히, 그리고 많은 양이 이동될 수 있다. 여러 가지의 진공이동장치(vacuum transfer device)들이 현재 상용으로 제조되고 있으며 진공 공간(vacuum chamber)을 다공성막(porous screen)으로 덮은 후 그 위에 nitrocellulose나 nylon membrane등의 support를 놓고 gel을 놓은 후 진공을 만들어 주는 방식을 취하고 있다. 완충용액은 상부의 reservoir로부터 solid support를 통해 진공공간으로 흐르고 핵산은 gel로부터 유출되어 membrane에 축적되게 된다. 진공을 이용한 이동방법은 모세관 현상을 이용한 이동보다 매우 효과적이며 이동에 소요되는 시간도 매우 짧다.

DNA는 염기성 용액으로 부분적인 depurination을 통해 변성된 후 일반적인 gel 두께인 4∼5 mm와 1% 이하의 agarose 농도의 gel로부터 30분 이내에 이동하게 된다. 성공적으로 수행되었을 경우 모세관 현상을 이용한 이동 방법에서 얻은 hybridization signal 보다 2배 내지 3배 강한 결과를 얻을 수도 있다.

이 장에서는 이러한 3가지의 이동 방법 중 가장 자주 사용되며 경제적인 방법이라 할 수 있는 모세관 현상을 이용한 방법을 설명하기로 한다.

A. Genomic DNA의 제한효소 절단

실험방법

1. 분석하고자 하는 genomic DNA 10 μg과 반응완충용액 및 증류수를 혼합하여 총 194 μl로 만든다음 4°C에서 2시간 정도 방치해 둔다.

2. 4 μl의 제한효소를 가하고 조심스럽게 혼합한 뒤 37°C에 두시간 보관한다. 유리막대를 이용하여 혼합하는 것도 좋은 방법이다.

3. 다시 2 μl의 제한효소를 더 가하고 두시간 반응시킨다음 반응혼합물 부피의 1/10을 agarose gel 전기영동하여 효소반응이 잘 진행되었는지 확인한다.

4. Phenol:chloroform 추출을 실시하여 수용액층을 분리한 후 2.5배의 ethanol을 첨가하고 -20°C에 1시간 이상 보관한다.

5. 4°C에서 10,000 rpm의 속도로 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거한 다음 침전물을 완전히 건조시키고 TE 용액 20 μl로 녹인다.

* 다음 단계에서 전기영동을 시행하기 위해 한 lane에 genomic DNA 약 10 μg이 필요하다. 그러므로 여러개의 lane에 시료를 가하기 위해서는 필요한 시료의 양을 잘 계산해야 한다.

* 실험단계를 간단히 하기 위해 과정 1의 4°C 방치와 과정 3, 4, 5를 생략할 수 있다. 필요에 따라 genomic DNA를 두가지 이상의 제한효소로 절단하여 실험할 수도 있다.

B. 모세관 현상을 이용한 Southern transfer

실험방법

1. 위에서 준비된 제한효소로 절단된 genomic DNA 시료를 0.7% agarose gel에 가한 후 100 V 전압을 걸고 2시간 동안 전기영동한다.

2. 전기영동이 끝난 gel을 조심스럽게 플라스틱 통에 옮겨 증류수로 세척한다.

3. Ethdium bromide를 0.5 μg/ml의 농도로 가한 후 gel을 적당 시간(10분 이상) 염색한 후 자외선하에서 확인한다.

4. 변성용액(1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH)에 gel이 충분히 담기도록 하여 천천히 흔들면서 45분간 방치하여 gel 내부의 DNA가 변성되도록 한다.

5. 증류수로 gel을 잠시 동안 세척한다.

6. Gel을 중화용액(1 M Tris-Cl, pH 7.4, 1.5 M NaCl)에 담가 상온에서 30분간 흔들어주면서 중화시킨다.

* Setting은 12장의 RNA 분석 편에 도해되어 있다.

7. 4와 6의 과정이 진행되는 동안 앞에서 보인 그림과 같은 장치를 준비한다.

8. 플라스틱 통위에 길이와 폭이 gel보다 길고 넓은 유리판을 눕히고 2장의 Whatmam 3MM 여과지를 이동완충용액(10x SSC 혹은 SSPE)에 적신 다음 유리판 위로 bridge를 만든다.

* 20x SSC : 3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate

9. 3MM 여과지가 이동완충용액으로 균일하게 젖은 후에 유리봉등으로 밀어서 공기방울을 제거한다. 또한 날카로운 칼등을 사용하여 nylon membrane을 gel 크기와 동일하게 자르고 가위로 한쪽끝을 잘라 방향을 표시한다.

10. 자른 nylon membrane을 증류수의 띄워서 균일하게 젖도록 하고, 완전히 젖으면 이동완충용액에 5분 이상 담가두어 평형을 이루도록 한다. Nylon membrane은 물에 잘 젖는다. 만일 nitrocellulose membrane을 사용할 경우 잘 젖지 않으므로 한쪽 모서리부터 서서히 물에 잠기도록 주의한다.

11. Gel을 중화시키는 용액으로부터 꺼내어 윗면이 아래쪽으로 향하도록 뒤집은 후 유리판 위에 걸쳐 놓은 3MM 여과지의 중심에 올려 놓는다. 매 과정에 공기방울이 남아 있지 않도록 주의한다.

12. Gel 위에 기포가 생기지 않도록 주의하면서 membrane을 올려놓는다.

13. Gel의 가장자리를 parafilm이나 랩으로 둘러 덮는다. 이때 gel 윗 부분까지 덮지 않도록 한다. 이러한 작업은 reservoir로부터 이동완충용액이 gel을 통하지 않고 직접 종이 흡수지로 이동하는 것을 방지하기 위한 것이다.

14. 플라스틱 통 속에 이동완충용액을 여과지가 충분히 잠길 정도로 부어 넣는다. 물론 유리판 위로 완충용액이 넘쳐서는 안 된다.

15. Gel 크기와 동일한 두장의 3MM 여과지를 10x SSC 용액에 적신 후 nylon membrane 위에 덮고 여러장의 종이 흡수지(paper pad)를 gel의 크기만큼 오려 10 cm 정도 높이가 되게 쌓는다.

16. 맨위에 유리판을 덮고 300 내지 500 g의 추로 눌러두고 8시간 내지 24시간 동안(overnight) 방치해 둔다.

17. Transfer(blotting)가 끝나면 membrane을 떼어내고 10x SSC에서 rinsing하여 membrane에 붙어 있는 agarose 찌꺼기등을 제거한 후 여과지 위에 놓아 공기 중에서 말린다.

* Transfer가 끝났는지의 여부는 gel을 다시 ethidium bromide 용액에 30분간 담가 염색한 후 자외선하에 비추어 보아 ethidium bromide에 의한 DNA의 band가 나타나는지의 여부로 알 수가 있다.

18. Membrane으로 옮겨진 DNA가 완전히 결합되도록 UV-cross linking을 실시하거나 80°C에서 2시간 동안 굽는다. Nitrocellulose membrane의 경우 UV-cross linking보다는 진공 상태로 80°C에서 2시간 동안 굽는 방법을 선호한다.

19. 사용할 때까지 membrane을 냉장고에 보관해 둔다.

C. Hybridization

실험방법

* 실험재료
Hybridization 용액: 6x SSC, 50% formamide, 5x Denhardt 용액, 0.1% SDS, 10 μg/ml herring sperm DNA (50x Denhardt's 용액은 1% polyvinylpyrrolidone, 1% bovine serum albumin, 1% Ficoll 400이며 filter한 후 4°C에 보관하였다가 사용한다.)

1. Membrane을 vinyl bag에 넣은 후 최소 부피의 hybridization 용액으로 membrane이 완전히 잠기도록(약 15 ml)로 vinyl bag속에 담는다.

* Hybridization 용액의 성분은 실험의 목적에 따라 다를 수 있으므로 최적의 조건을 찾도록 노력해야 한다.

2. 기포를 완전히 제거한 후 sealing을 한다.

* 부피를 최소한으로 해야 용액 내의 probe 농도가 진해지므로 반응이 잘 일어나게 되는데, 옛날에는 vinyl bag을 많이 썼지만 최근에는 bottle을 이용한 기구가 나와 있고, 용액이 마르지만 않는다면 보통 플라스틱 통으로 해도 된다.

3. 42°C shaking incubator에 1시간 이상 보관해 둔다. Probe를 넣고 hybridization 반응을 시키기 전에 실시하는 과정이므로 이를 prehybridization이라고 한다.

4. Vinyl bag의 한쪽 끝을 절단하고 용액을 빼낸 후 15 ml의 hybridization 용액과 함께 제조한 probe를 넣는다.

5. 기포가 생기지 않도록 잘 sealing한 다음 42°C shaking incubator에 하룻밤 방치해 둔다.

6. 하룻밤 hybridization시킨 vinyl bag을 열고 용액을 모두 제거한다.

* Hybridization 용액에는 강한 동위원소가 포함되어 있으므로 취급 과정은 법에 따라 행해야 한다.

7. 상온에서 세척용액 1(2x SSC, 0.1% SDS)을 교체해가며 30분간 membrane을 세척한다.

* 세척에 필요한 시간이나 온도, 세척용액의 성분 등은 반응조건에 따라 달라질 수 있으므로 최적 조건을 찾아서 시행해야 한다.

8. 55°C에서 세척용액 2(0.2x SSC, 0.1% SDS)을 교체해가며 30분간 membrane을 세척한다.

9. Membrane을 상온에서 완전히 건조시키고, membrane 뒤에 Whatman 3MM 종이를 대고 랩으로 싼 다음 cassette에 고정시키고 암실에서 X-ray film을 넣은 후 cassette를 장착시킨다.

10. -70°C에 하룻밤 보관해 둔 후 film을 현상하여 결과를 관찰한다.

참고사항 - 한번 사용한 membrane으로 다시 다른 probe을 사용하여 hybridization 하기

이 과정에서는 0.2 N NaOH(강염기)를 이용하므로 nitrocellulose membrane은 부서지기 쉬워서 사용하기 어렵다. 즉 nylon membrane을 이용하는 것이 좋다.

1. 한 번 사용한 membrane을 충분한 양의 0.2 N NaOH 용액속에 담근다.

2. 42°C shaking incubator에 30분 이상 보관하여 결합되어 있는 probe가 떨어지도록 한다.

* Probe가 떨어졌는지의 여부는 Geiger counter를 이용하면 된다.

3. Membrane을 충분한 양의 세척용액(0.1x SSC, 0.2 M Tris-HCl pH 7.6)속에 담근 후 42°C에서 흔들면서 30분 이상 둔다.

4. Membrane을 꺼내어 습기를 대충 제거한다.

5. 공기 중에서 완전히 말린 후 4°C에 보관하였다가 재사용한다.