첫번째로 Stratagene 회사에서 개발하여 판매하는 QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit를 이용한 방법인데, 모두 6시간 정도가 소요된다. Mutation을 가진 두개의 상보적인 염기서열의 oligonucleotide를 primer로 사용하고, plasmid 상태의 DNA를 template로 사용하여 새로이 mutation을 가진 plasmid를 시험관에서 증폭, 합성한 다음, 원래의 wild type은 Dpn I 제한효소로 절단하여 제거하는 방법이다. 보통 실험실에서 사용하는 E.coli는 Dam methylase를 가지고 있어서 이들에서 분리된 모든 DNA의 경우 GATC 염기서열의 A가 methylation 되어있다. 즉 template로 사용한 wild type DNA는 E.coli에서 분리된 DNA로서 G^m6ATC를 인식하여 절단하는 Dpn I에 의하여 절단되지만 시험관에서 합성한 mutant DNA는 절단되지 않는다. Dpn I으로 처리한 DNA를 E.coli host에 transformation 시킴으로써 높은 확률로 mutant를 가진 clone을 얻을 수 있다.

두번째 방법은 uracil를 함유한 single-stranded DNA를 이용하는 방법이다. 두개의 중요한 DNA repair 효소인 dUTPase(dut)와 uracil N-glycosylase(ung) 유전자의 결함이 있는 E.coli strain에서는 thymine 대신에 소량의 uracil을 함유한 DNA가 합성되게 된다. 이와 같은 dut-, ung- strain에서 만든 single-stranded phagemid DNA를 template로 하고 mutation을 함유한 oligonucleotide를 primer로 시험관내에서 double-stranded circular DNA를 합성하여 wild type E.coli에 넣어주게 되면, 두 가닥의 strand 중에 uracil을 함유한 phagemid DNA는 선택적으로 제거되고 시험관에서 합성된 DNA가 template로 이용되어 복제가 일어난다. 이 방법은 비교적 비용이 적게 든다는 장점이 있지만, uracil이 함유된 ssDNA를 제조하여야 한다는 불편함이 있다.

세번째 방법은 PCR을 이용하여 mutation을 함유한 DNA fragment를 만들어 subclone을 제조하는 방법이다. 네개의 primer를 합성해야 하므로 비교적 비용이 많이 드나 요즘 oligonucleotide 합성 가격이 내려가서 비용 부담이 적어졌다.

세가지 방법 모두 하루에 transformation까지 할 수 있고 높은 성공률을 보장하므로 어떤 방법을 이용하여도 안전하다.

A. QuickChange site-directed mutagenesis

 실험방법

* 실험재료
Pfu DNA polymerase(2.5 U/μl)
10x reaction buffer[100 mM KCl, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-Cl, pH 8.8, 20 mM MgSO₄, 1% Triton X100, 1 mg/ml bovine serum albumin]
Oligonucleotide primer: 원하는 mutation을 가지고 있는 서로 상보적인 두개의 primer가 필요하다. 보통 primer 크기는 30mer 내외로 하고 mutation 위치는 중앙에 위치하게 한다.
dNTP mix(10 mM, each)
Competent cell
Dpn I(10 U/μl)

1. 아래와 같이 반응액을 PCR tube에 준비한다.

10x reaction buffer 5 μl
Plasmid DNA(10 ng/μl) 1 μl
Oligonucleotide primer #1(10 pmole/μl) 1.25 μl
Oligonucleotide primer #2(10 pmole/μl) 1.25 μl
dNTP mix 1 μl
ddH₂O to 50 μl

2. 최종으로 Pfu DNA polymerase를 1 μl 첨가하고 섞은 후 PCR을 시행한다. PCR cycle 온도와 시간은 아래와 같이 한다.

95°C 30초, 1회
95°C 30초, 55°C 30초, 68°C 10분, 15회
4°C 보존

3. 반응이 종료되면 Dpn I(10 U/μl) 효소 1 μl를 직접 PCR 반응액에 첨가하고 섞은 후, 37°C에서 1 시간 반응시킨다.

4. Dpn I을 처리한 용액 1 μl로 XL1이나 DH5α 등의 E.coli에 transformation 시킨다.

B. Uracil을 함유한 phagemid ssDNA를 template로 한 site-directed mutagenesis

실험방법

* 실험재료
1. E.coli strains
a. CJ236, dut^-, ung^-이고 chloramphenicol 내성 유전자를 marker로 한 F' episome을 가지고 있어서 phagemid ssDNA를 만들어낼 수 있다.
b. Wild type dut⁺, ung⁺ strain으로서 DH5α, JM109, NM522, XL1-Blue 등을 모두 이용할 수 있으며, F' episome을 함유할 필요는 없다.
2. Helper phage: M13K07 혹은 VCSM13 helper phage로서 10¹¹~10¹² phage particle/ml 이상의 titer 이어야 한다.
3. Kanamycine(75 mg/ml, -20°C)
4. PEG/NaCl(20% PEG 6000 혹은 8000, 2.5 M NaCl)
5. T4 polynucleotide kinase(10 U/μl)
6. 10x kinase buffer(0.5 M Tris-Cl, pH 7.5, 0.1 M MgCl₂, 50 mM DTT, 0.5 mg/ml bovine serum albumin)
7. T4 DNA polymerase
8. 10x T4 DNA polymerase buffer
9. dNTP mix(10 mM, each)
10. ATP(10 mM)
11. Mutagenic primer: phagemid ssDNA에 상보적인 염기서열로서 20mer 이상이며, mutation이 중앙 부위에 위치하게 한다. 농도는 10 pmoles/μl로 한다.

Uracil을 함유한 single-stranded phagemid DNA 분리

1. Plasmid를 CJ236에 transformation시킨 후 한 개의 colony를 3 ml TB medium에 접종한다.

2. Helper phage 10 μl를 첨가하고 37°C에서 2시간 배양한다.

3. Kanamycine을 3 μl 첨가하고 계속하여 밤새 배양한다.

4. 배양액 1.4 ml을 1.5 ml-eppendorf tube에 옮긴 뒤 14,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 새 tube에 옮긴다. 다시 5분간 원심분리하여 1.2 ml 상층액을 새로운 tube로 옮긴다.

5. 상층액 1.2 ml에 300 μl의 PEG/NaCl 용액을 첨가하고 섞는다. 얼음에서 30분간 방치한 후에 14,000 rpm에서 2분간 원심분리하여 phage 침전을 얻는다. 다시 짧게 원심분리하여 남아있는 용액을 모두 제거한다.

6. 침전물을 150 μl의 TE 용액에 부유시킨 후, 150 μl의 phenol을 첨가하고 진탕한다. 원심분리를 14,000 rpm에서 10분간 하여 상층액을 얻는다. 다시 150 μl의 chloroform을 넣고 진탕하여 같은 방법으로 원심분리하고 상층액을 얻는다.

7. 3 M sodium acetate 용액 15 μl를 첨가한 후에 300 μl의 ethanol을 첨가하여 -20°C에서 15분 방치한다. 원심분리를 14,000 rpm에서 10분간 하여 DNA를 침전 시킨다. 침전물은 다시 짧게 원심분리하여 남아있는 용액을 완전히 제거한다. 침전물은 50 μl의 TE에 용해시킨다.

* 이상과 같이하여 얻은 ssDNA는 보통 10 μg 정도로, 전기영동상 helper phage ssDNA와 phagemid ssDNA, 두개의 주된 band를 관찰할 수 있다.

Primer phosphorylation , DNA duplex formation, and transformation

8. 아래와 같이 반응액을 섞은 후 37°C에서 1시간 30분 방치한다.

10x kinase buffer 2 μl
Mutagenic primer(100 pmoles/μl) 1 μl
10 mM ATP 2 μl
H₂O 14 μl
T4 polynucleotide kinase(10 U/μl) 1 μl

9. 반응을 멈추기 위하여 75°C에 15분간 방치한다. 간단히 원심분리하여 내용물을 tube 바닥으로 모은다.

10. 새로운 시험관에 아래와 같이 반응액을 만든다.

10x T4 DNA polymerase buffer 1 μl
Uracil-containing ssDNA 2 μl
Phosphorylated mutagenic primer 1 μl
H₂O 6 μl

11. 75°C의 heat-block에 tube를 넣고 block을 chamber에서 꺼내어 상온에서 서서히 식도록 한다.

12. Block의 온도가 35°C 정도까지 떨어지면 얼음에서 옮겨 식히고, 간단히 원심분리하고 내용물을 바닥으로 모은다.

13. 아래와 같이 첨가하여 섞은 뒤 37°C에서 2시간 방치한다.

10x T4 DNA polymerase buffer 1 μl
10 mM ATP 2 μl
2.5 mM dNTP 4 μl
T4 ligase 1 μl
T4 DNA polymerase 1 μl
H₂O 1 μl

14. 이 용액 5~10 μl로 XL1-Blue competent cell을 transformation 한다.

C. PCR을 이용한 site-directed mutagenesis

실험방법

* 실험재료
1. 10x reaction buffer
2. Oligonucleotide: 그림에서 보는 P1, P4는 mutation 부위로부터 5' 혹은 3' 쪽의 primer로서 plasmid의 sequencing primer를 사용하여도 무방하다. Mutagenic primer인 P2와 P3는 20 base 정도가 complementary 하여야 하며, mutation 위치는 complementary한 부위의 중앙에 위치하게 한다. 각 primer의 농도는 50 pmoles/μl로 한다.
3. dNTP mix(10 mM, each)
4. Template DNA: plasmid DNA를 사용할 수 있으며, 농도는 10 ng/μl로 만든다.
5. Taq polymerase (2.5 U/μl)

1. 아래와 같이 두 개의 PCR tube에 반응액1과 반응액2를 준비한다.

반응액1
10x reaction buffer 5 μl
dNTP mix 1 μl
Template DNA 1 μl
Primer P1과 P2 각각 0.5 μl
H₂O 41 μl
Taq polymerase 1 μl

반응액2
Primer P1 과 P2 대신에 primer P3 와 P4 를 사용하고 그 외는 반응액1 과 동일하다.

2. 1차 PCR을 아래와 같이 시행한다.

94°C에서 5분 1회,
94°C 30초, 55°C 30초, 72°C 1분(template 길이에 따라 적당히 조절한다.), 25회,
72°C에서 10분

3. 반응액1과 반응액2를 이용하여 2차 PCR을 시행한다.

10x reaction buffer 5 μl
dNTP mix 1 μl
반응액1과 반응액2 각각 1 μl
Primer P1과 P4 각각 0.5 μl
H₂O 40 μl
Taq polymerase 1 μl

94°C에서 5분 1회,
94°C 30초, 55°C 30초, 72°C 1분(template 길이에 따라 적당히 조절한다.), 25회,
72°C에서 10분

* 1차 PCR에서 증폭한 DNA는 agarose gel electrophoresis로 분리하여도 좋으나 바로 사용하여도 무방하다.

4. 2차 PCR에서 증폭된 DNA를 plasmid vector에 subcloning 한다.