제한효소는 3가지로 나눌 수 있으며, 실험실에서 사용되는 것은 대부분 type II이다.

1) Type I restriction enzyme

DNA의 특정부위를 인식하긴 하지만 인식된 부위가 아닌 다른 부위를 절단한다. 즉, 인식부위는 특이성을 가지지만 그로부터 약 1,000 base pair가 떨어진 부위를 절단하기 때문에 원하는 부위를 선택하여 자르기가 어렵다. 따라서 이 효소들은 박테리아의 기능에는 중요하지만 실험목적으로는 잘 사용되지 않는다.

2) Type II restriction enzyme

인식부위와 절단부위가 모두 특이성이 있는 제한효소이므로 분자생물학 연구에 아주 유용하게 이용되고 있다. 실험에 쓰이는 제한효소는 특별한 말이 없는 한 type II를 말한다. 대부분의 type II 제한효소는 4개, 5개, 또는 6개의 염기서열을 인식하는데, 이에 따라 DNA 상에 인식부위가 나타나는 빈도가 달라지게 된다. 즉 6개의 염기서열을 인식한다면 이론상 4⁶ = 4096 base pair 마다 한번씩 출현하게 된다. 제한효소의 명명은 발견된 세균의 이름 및 serotype에 따라서 붙이게 된다. 즉 Hinf II는 Haemophilus influenza type f에서 분리된 것이다.

제한효소가 인식할 수 있는 부위는 palindrome, 즉 앞으로 읽으나 뒤로 읽으나 염기서열이 같은 모양을 하고 있는 것이 특징이다. 잘린 후의 DNA 모양은 5'-overhang cohesive end, 3'-overhang cohesive end(sticky end) 또는 blunt end가 만들어질 수 있으므로 목적에 따라서 잘 선택해서 사용해야 한다.

예1) EcoR I 효소의 절단 부위: 5'-overhang cohesive end 형성

5'--GAATTC--3' → 5'--G AATTC--3'
3'--CTTAAG--5'     3'--CTTAA G--5'

예2) Sac I 효소의 절단 부위: 3'-overhang cohesive end 형성

5'--GAGCTC--3' → 5'--GAGCT C--3'
3'--CTCGAG--5'     3'--C TCGAG--5'

예3) Sma I 효소의 절단 부위: blunt end 형성

5'--CCCGGG--3' → 5'--CCC GGG--3'
3'--GGGCCC--5'     3'--GGG CCC--5'

3) Type III restriction enzyme

인식한 DNA 부위에서 어느 정도 떨어진 부위를 절단한다. 분자생물학 실험에는 잘 사용되지 않고 있다.

A. 제한효소를 이용한 DNA의 절단

제한효소 1 unit는 1 μg의 DNA를 최적 온도에서 한 시간에 절단할 수 있는 양이다. 상품화된 효소는 효소마다 다르지만 대개 10 units/μl 내외의 농도로 공급된다.

제한효소 처리 반응은 절단하려고 하는 DNA, 반응완충용액, 제한효소로 구성된다. 각각의 성분에 대하여 다음과 같은 점들을 고려하여야 할 것이다.

1) 자를 DNA 내에 제한효소로 잘리는 부위가 몇 개가 되는지 파악한다. 같은 양의 DNA에 제한효소 절단부위가 무수히 많을 수도 있고 없을 수도 있으며, 이들 경우에 같은 양의 효소작용을 기대할 수 없을 것이다. 그러나 보통 실험에서는 계산된 양보다 더 많은 효소를 넣어주기 때문에 그다지 걱정할 필요는 없다.

2) Linear DNA의 끝부분을 자를 때는, 효소에 따라서 인식서열에 몇개의 염기가 더 붙어 있어야만 잘리는 것들이 있음을 주의한다. 이는 plasmid vector의 multiple cloning site를 두가지 효소로 자르는 경우에도 고려해야한다. 또한 PCR primer에 제한효소 인식부위를 넣어 design할 경우에도 반드시 고려해야 한다.

3) DNA의 순수도는 제한효소 처리 효율에 중요하다. DNA 용액 내에 단백질이 남아있는 경우는 보다 많은 양의 효소가 필요하다. Phenol과 같은 유기용매가 남은 경우는 제한효소에 잘리지 않는 DNA가 남는 경우가 많다.

4) 각각의 제한효소는 최적온도, 반응완충용액(reaction buffer)의 조성 및 불활성화 온도 등 각각에 알맞은 반응 조건이 있으며, 제조회사의 안내서에 이 내용이 잘 기록되어 있으므로 잘 읽어보고 사용해야 한다. 어느 회사의 제품이건 효소를 구입할 때 그 효소에 적합한 반응완충용액이 같이 지급되므로 별 어려움 없이 그대로 사용할 수 있으며 대개 10배 농축된 형태(10x)로 만들어져 있으므로 반응액을 조합할 때 10배 희석하는 형태로 반응액을 조성한다.

5) 반응 조건이 최적이 아닌 경우에는 더 많은 양의 효소를 사용해야 한다. 이는 두가지 이상의 효소로 자르는 경우 (효소들의 최적 조건이 다를 때)에 중요하다. 때에 따라서는 이런 경우에 star activity라 불리는 현상(비특이적으로 아무 곳이나 다 잘리는 현상)이 나타날 수도 있으므로 주의해야 한다.

6) 효소가 인식부위를 자르는 데에 있어서 같은 인식부위라도 주위 염기서열에 따라 그 활성도가 다를 수 있다. 그러므로, DNA 양으로 계산한 효소 양보다 조금 더 많이 넣어주는 것이 좋다. 필요할 때는 제한효소 처리 중에 조금씩 덜어 전기영동으로 monitor할 수도 있다.

실험방법

1. 미세 원침관에 micropipette으로 다음과 같이 넣는다.

절단하고자 하는 DNA             5 μg
10x 반응완충용액                   2 μl
BamH I 제한효소 (10 units/μl) 1 μl
증류수 up to 20 μl

* 위와 같은 혼합물을 시험관에 넣을 때에는 보통 효소를 가장 마지막에 넣는 것이 좋다.

* 효소 원액에는 glycerol이 들어있기 때문에 점도가 높아서 pipetting할 때 tip 끝만 살짝 담구어서 덜어내어야 tip 주위에 효소가 많이 뭍어나오는 것을 막을 수 있다. 또한 효소량이 반응 총액의 10%를 넘으면 효소 활성이 glycerol에 의해 억제될 수 있기 때문에 주의해야 한다. 총 부피는 대개 20 μl로 한다.

* 효소는 -20°C에서 50% glycerol이 들어있는 완충액내에서 안정하게 존재하므로 반드시 냉동실에 보관하고 실온에 노출되는 시간을 가능한한 줄인다.

2. 기포가 생기지 않게 주의하면서 섞는다. 섞는 방법은 pipette을 up-down하는 방법, 손가락 끝으로 가볍게 툭툭 치는 방법(tapping), 부드럽게 vortex하는 방법 등이 주로 쓰인다. 심하게 vortex하지 않는다.

3. 약 3~5초간 원침(brief centrifuge)하여 반응할 재료들이 바닥에 모이도록 한다.

4. 37°C(효소에 따라서 다를 수 있음)에서 적당 시간 반응시켜 DNA가 충분히 절단되도록 한다. 대개 1~2 시간 반응시킨다.

5. 반응액에 전기영동 완충용액을 첨가하여 agarose gel 전기영동을 시행한다. 또는 혼합액을 불활성화 시키기 위하여 65°C로 20분동안 가열하거나 0.5 M EDTA (pH 8.0)을 최종농도 10~50 mM 되도록 첨가한다.

* 불활성화 온도는 효소마다 조금씩 다르므로(65~85°C) 제조회사의 안내서를 참고한다. EDTA 용액을 이용하는 방법은 자른 DNA를 사용하여 곧바로 다른 반응을 해야 할 경우에는 반응을 억제할 수 있으므로 피하여야 한다. 다른 반응으로 들어가는 경우는 반응액내에 있는 단백질(효소) 및 salt의 제거를 위해서 phenol/chloroform 추출을 한 후 ethanol로 침전시키는 방법도 있지만 DNA 양이 적을 때는 손실의 우려가 있다. 최근에는 여러 회사에서 판매되는 DNA purification kit 들이 있으므로 이를 사용하는 것도 좋다. DNA를 바로 전기영동할 때는 불활성화시킬 필요가 없다.

* DNA sample이 잘 잘리지 않은 경우 다음과 같은 사항을 check해 본다.

1) 효소가 inactive하다. (오래된 효소인 경우일수록 활성이 감소해 있을 수 있다. 그러나 무엇보다 상온에 오래 있었거나 보관 상태가 불량한 경우가 많다. 이 경우는 test DNA를 함께 잘라 봄으로써 검사한다.)

2) DNA가 순수하지 못하다. (salt, polyethylene glycol, protein, EDTA, phenol, SDS, residual ethanol 등이 남은 경우 흔히 발생한다. 이 경우는 phenol/chloroform 추출-ethanol 침전-70% ethanol wash를 다시 시행하여 제한효소 처리함으로써 좋은 결과를 볼 수 있다. 반응액에 2 mM spermidine을 첨가해 주면 더 효과적일 수 있다.)

3) DNA가 완전히 용해되어 있지 않거나 너무 점성이 크거나 또는 너무 진하다. (이런 경우는 커다란 genomic DNA에서 잘 발생된다. 잘 녹이고 더 묽게 하여 자른다.)

4) DNA가 denaturation 되어있다. (적당한 salt나 MgCl₂같은 것이 없는 상태에서 60~70°C이면 denaturation될 수 있다. 자르지 않은 undigested DNA를 함께 전기영동하여 비교해보면 된다.)

5) DNA가 degradation되어 있다. (이 경우도 undigested DNA를 함께 전기 영동해 본다. 때로는 undigested DNA는 degradation되어있지 않은데도 제한효소로 자르면 DNA가 조각나는 경우를 경험할 수 있다. 이 때는 제한효소의 star activity를 의심하기도 하고 제한효소가 너무 많은 경우 또는 완충용액이 맞지 않는 경우도 있지만 시약들 중 일부가 오염되어있는 경우가 많으므로 시약들을 바꾸어 실험해 보는 것이 좋다.)

B. 두가지 제한효소를 이용한 DNA의 절단

두가지 제한효소를 사용하는 경우는 다음과 같은 사항에 유의한다.

1) 우선 제한효소로 잘리는 부위가 너무 가깝지나 않은지 등 위에서 설명하였듯이 상세히 실험 design을 검토해 본다.

2) 두 제한효소의 반응조건을 검토해본다.

두가지 제한 효소의 절단은 One-phor-all buffer를 사용하는 것이 가장 쉽고 빠른 방법이다. One-phor-all buffer(Pharmacia)란 대부분의 제한효소에 적당하도록 그 조성을 결정하여 만든 buffer이며, 제한효소에 따라서 최종으로 10배 또는 5배(드물게 20배도 있음) 희석하여 사용할 수 있다. 그러므로 수많은 효소 중에서 10배 희석하여 쓰는 group의 제한효소들끼리, 5배 희석 효소들끼리는 쉽게 최적 조건이 맞추어질 수 있다.

3) 두 제한효소의 고유 조건이 같으면 고유 buffer를 쓴다.

즉, BamH I과 Hind III로 double digestion하는 경우, 같은 B buffer에 37°C incubation을 하면 되니까 별 문제가 없다.

4) 두 효소의 buffer가 다르면 One-phor-all buffer의 조건을 맞추어 본다.

예를 들어 Xba I은 H buffer이고 Sac I은 A buffer로 다르지만, One-phor-all buffer를 쓰면 둘 다 10배 희석(final 1x)으로 쓰면 되는 것이다.

5) 위의 사항에 모두 맞지 않는 경우는 어쩔수 없이 하나씩 처리해야 한다. 이런 경우는 다음과 같은 방법이 있다. 먼저 낮은 salt 농도에서 활성이 있는 효소로 먼저 자른 후 다음에 처리할 효소 반응액의 salt 농도에 맞게 1 M NaCl을 소량 첨가하여 조정한다. 혹은, 한가지 효소로 자른 후에 phenol-chloroform 추출을 시행한 후 침전하고 다음 효소를 반응시킨다. 열처리로도 효소를 불활성화시킬 수 있으나 완충용액의 성분이 그대로 남아있으므로 좋지 않다.

6) 시약 회사에서 추천하는 완충용액의 종류가 다른 경우에는 활성이 약한 완충용액을 사용하는 경우 효소의 양을 증가시켜 사용해도 무방하다. 예를 들어 EcoR I과 BamH I을 함께 사용하는 경우 H 완충용액을 사용하면 Bam HI의 활성이 25∼50%밖에 나타나지 않으므로 BamH I 효소의 양을 평상시보다 2∼4배 정도 사용하면 된다. 이때 B 완충용액을 사용하는 경우는 star activity가 생길 수 있으므로 주의한다. 이런 현상은 EcoR I과 BamH I을 혼합하여 자를 때 잘 발생한다.

7) 두가지 효소를 사용하는 경우에도 효소량이 반응 총액의 10%를 넘지 않도록 한다.

8) 최적온도가 다른 두가지 효소를 처리하는 경우 반응액의 조성은 그대로 두고 온도를 번갈아 처리해도 된다. 그러나 이 경우에도 따로따로 처리하는 것이 바람직하다.

실험방법

1. 미세 원침관에 micropipette으로 다음과 같이 넣는다.

절단하고자 하는 DNA            5 μg
10x One-phor-all buffer         4 μl
BamH I 제한효소 (10 units/μl) 0.5 μl
Eco RI 제한효소 (10 units/μl) 0.5 μl
증류수 up to 20 μl

* 위에서는 두가지 효소가 모두 One-phor-all buffer가 최종 2x일때 최적 조건이 되는 경우이다. 효소량을 높이고 싶은 경우 총 반응 부피를 늘리는 것이 좋다.

2. 한가지 제한효소를 처리할 때와 같이 실험을 진행한다.

C. 제한효소를 이용한 DNA의 부분적인 절단

이와 같은 실험방법은 cloning하고자 하는 DNA 단편내에 동일한 제한효소 절단부위가 존재하는 경우 또는 제한효소 지도(restriction map) 제작시에 필요한 방법이다. 실험방법은 위에서와 다르지 않지만, 원하는 부분절단 단편(partial digested fragment)를 최대한으로 얻기 위하여 제한효소량이나 반응시간의 조건을 결정하는 작업이 필요하다.

실험방법

1. 미세원침관에 절단하고자 하는 DNA와 1x 반응완충용액을 포함한 반응혼합액 100 μl를 준비한다.

2. 5개의 미세원침관을 준비하고 반응혼합액을 얼음 속에서 다음과 같이 나눈다.

원침관 1은 30 μl, 원침관 2, 3, 4는 20 μl, 원침관 5는 10 μl

3. 제한효소 1 μl를 원침관 1에 첨가한 후 잘 혼합한다.

4. 원침관 1에서 10 μl를 취해서 원침관 2에 첨가한 후 신속히 잘 섞는다. 계속해서 원침관 2에서 3으로, 3에서 4로, 4에서 5로 10 μl 씩 신속히 옮겨 담으면 다섯 원침관 모두 20 μl 씩 담긴 혼합액이 된다(효소는 1/3로 점차적으로 희석됨). 각 원침관을 모두 얼음에 놓아두어야 한다.

5. 다섯개의 반응을 동시에 얼음에서 꺼내어 제한효소의 적당한 반응온도(37°C)에서 적당 시간(약 15분) 반응시킨다.

6. 0.5 M EDTA 용액을 최종농도 12.5 mM이 되도록 0.5 μl 씩 첨가하여 반응이 정지되도록 한다.

7. 전기영동을 시행하여 확인한다.

* 이 방법은 효소의 양이나 반응시간에 따라서 반응의 차이가 아주 민감하게 나타나므로 실험목적에 따라서 최적의 조건을 조정해 주는 것이 중요하다. 경험이 대단히 요구되는 방법이다. 어떤 실험자는 효소의 양을 변화시키는 대신에 반응시간으로 조절하기도 한다.