A. 배양세포로부터 단백질의 분리

1) 전체 세포단백질(whole cellular extract)의 분리

실험방법

1. 단층으로 자란 배양세포를 1 ml의 PBS로 두번 세척한다.

2. 배양접시에 붙은 상태로 얼음에 올려놓고 300 μl의 용해용액(RIPA 용액: 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% DOC[deoxycholic acid], 0.1% SDS, 50 mM Tris-Cl, pH 7.5)을 가한다.

3. 30분간 가끔씩 흔들면서 얼음에 둔다.

4. 1 ml pipette을 사용하여 수차례에 걸쳐 lysate를 올렸다, 내렸다를 반복하여 뻑뻑하지 않을 때까지 시행하면 genomic DNA가 모두 shearing 되었다고 볼 수 있다.

5. 이 용액을 미세원침관으로 옮기고 4°C,15,000 rpm에서 10분간 원심분리한다.

6. 상층액(세포단백질)을 새 미세원침관으로 옮긴다. 이 용액은 SDS-PAGE에 이용할 수 있다.

2) 핵단백질(nuclear extract)의 분리

핵단백질의 분리는 1단계의 핵분리과정과 2단계의 단백질 분리과정으로 나눌 수 있으며, 핵을 분리하는 방법에 따라서 여러가지 방법이 있다. 순수한 핵단백질을 원하는 경우 핵분리를 순수하게 해야 하지만 시간과 노력이 많이 들기 때문에 여러가지 세포에서 동시에 분리하기에는 어려움이 많다. 여기에 소개하는 방법은 Schreiber 등(1989)이 소개한 간단한 방법이다.

* 실험재료
용액 A: 10 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA로 구성되고, 사용 직전에 DTT(dithiothreitol)을 1 mM로, PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 0.5 mM로, 그리고 여러가지 protease inhibitor cocktail을 목적에 따라 만들어서 첨가하여 사용한다.
10% NP-40
용액 C: 20 mM HEPES, pH 7.9, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA로 구성되고, 사용 직전에 DTT를 1 mM로, PMSF를 1 mM로, 그리고 protease inhibitor cocktail을 첨가하여 사용한다.

1. 단층배양세포를 1 ml의 PBS로 두번 세척하고 0.5 ml의 PBS를 첨가한다음 policeman으로 긁어 미세원침관으로 옮긴다.

2. 4°C 원심분리기에서 15,000 rpm으로 1~2분간 원심분리한다.

3. 상층액을 제거하고 PCV(packed cell volumn)을 가늠해본다. 세포에 따라 다르지만, 10 cm 배양접시에 confluent 상태로 자란 세포(약 10⁷)에서 시작한 경우 약 100 μl 정도 될 것이다.

4. 용액 A를 400 μl 넣고 부드럽게 pipette으로 풀고 약하게 vortex한 후, 얼음에 15분간 둔다. 이 과정에서 세포가 용해되기 시작한다. 핵막은 보존되는 상태이다.

5. 10% NP-40을 25 μl 넣고 10초간 세게 vortex한 후 4°C에서 15,000 rpm으로 1~2분간 원심분리한다. 상온에서 최고속도로 30초 원심분리하기도 한다.

* 세포의 종류에 따라서 NP-40의 농도를 변화시키는 것이 좋은데, 이를 넣지 않는 실험자도 많이 있다. 새로운 세포주를 사용할 때마다 NP-40을 첨가하기 전에 현미경으로 세포막의 파괴 유무를 확인하고, 이로부터 NP-40을 1 μl부터 조금씩 증가시켜보면서 현미경 관찰을 하여 조건을 정해주어야 한다.

6. 상층액을 버리고 침전된 핵의 부피(packed nuclear volumn, PNV)를 가늠해본다. 이를 50 μl의 용액 C에 풀고, 4°C에 설치된 shaker에서 비교적 강하게(level 6~7) 흔들면서 15분간 둔다.

7. 4°C 원심분리기에서 최고속도로 5분간 원심분리한다. 상층액이 핵단백질이다. 약간의 하얀 물질이 딸려올 수 있는데, SDS-PAGE 및 western blot 용으로는 큰 문제가 없다.

* 0.5~1.0×10⁶ 세포에서 출발한 경우 1~2 μg/μl 농도로 총 55~100 μg의 단백질을 얻을 수 있다.

B. 단백질의 정량

대표적으로 Bradford 방법과 Lowry 방법이 있는데, 여기서는 Bradford 방법을 간단하게 기술하기로 한다.

실험방법

* 실험재료
Bradford 시약: 100 mg Coomassie brilliant Blue G-250을 50 ml absolute ethanol에 녹이고 100 ml of concentrated phosphoric acid를 넣은다음 증류수로 200 ml 까지 채운다. 이 용액은 6 x 의 상태로서 사용시에는 이 용액과 증류수를 1 : 5의 용량비로 섞은 후 filter paper로 1회 거른 후 사용한다.
표준용액원액: 10 mg/ml bovine serum albumin(BSA)를 주로 사용한다.

1. 미세원침관에 다음과 같이 표준용액을 만든다.

* 이들의 최종 농도는 Bradford 시약을 1 ml(정확히는 980 μl) 첨가한 경우 각각 0, 5, 10, 15, 20 μg/ml이다.

2. 측정하고자 하는 단백질을 적당히 희석하여 증류수로 20 μl로 만든다. 예상되는 농도가 위 표준용액의 범위안에 있어야 한다.

3. 각 원침관에 모두 1 ml의 Bradford 시약을 넣고 잘 섞는다.

4. 10~30분 정도 두었다가 595 nm에서 흡광도를 측정하고, 표준용액을 이용하여 회귀방정식을 세우고 미지 단백질의 농도를 계산한다. 이때, 과정 2에서 희석한 것을 잊지 않도록 한다.

C. 단백질의 전기영동(SDS-PAGE)

Acrylamide gel은 DNA 또는 단백질의 전기영동에 이용될 수 있는데, 특히 단백질의 경우는 SDS (sodium dodecyl sulfate)를 포함한 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시한다. Polyacrylamide gel은 acrylamide 측쇄 기능기가 N, N'-methylenebisacrylamide와 같은 2개의 기능기를 가지는 화합물에 의해 교차연결(cross-link)되어 형성된 polymer이다. SDS-PAGE의 효과적인 분리 범위는 polyacrylamide의 농도와 교차연결 정도에 의해 결정되며 교차연결시키는 물질이 없는 상태에서 형성된 acrylamide polymer는 쓸모없는 점액성 용액을 이루게 된다.

표 1. SDS-polyacrylamide gel의 효과적 분해 범위

Bisacrylamide에 의해 교차연결되어 생긴 gel은 gel 자체의 강도와 탄성을 유지하고 SDS-polypeptide가 통과할 작은 구멍을 형성한다. 이 구멍의 크기는 bisacrylamide:acrylamide의 비율이 증가할수록 감소하여 약 1:20 정도에서 가장 작게 된다. 대부분의 SDS- polyacrylamide gel은 1:29의 몰비율로 제조하며 이에서 분자량이 3% 정도의 차이가 있는 polypeptide를 분리할 수 있다.

Disc gel 전기영동의 원리

보통 SDS-PAGE는 두가지의 다른 gel이 붙어있는 상태인 Disc(discontinuous pH 또는 disc) gel 전기영동으로 시행하게 된다. 이를 사용하면 단백질 시료가 gel에 apply되었을 때 모든 시료가 같은 점에서 출발할 수 있도록 압축이 되고, 그다음에 성질에 따라 분리되게 된다. 따라서 두 gel의 농도나 pH가 다르게 설정되어 있다. 윗부분의 gel은 stacking gel이라 부르며, acrylamide 농도는 주로 3~5%이고 pH는 running gel보다 2 정도 낮은 6.5를 주로 쓰게된다. 아래의 gel은 running gel, resolving gel, separating gel 등으로 불리며, acrylamide 농도는 분리하고자 하는 단백질의 크기에 따라 6~15%를 주로 사용한다.

Gel의 윗부분 완충용액(upper chamber buffer)의 glycine은 아미노산의 성질로 인해 음전하를 띠거나 net charge가 0인 zwitter이온 형태로 존재한다.Gel에 형성된 well에 단백질 시료를 가하고 전기영동을 시작하면 Cl^-이온과 단백질, glycine^-이온이 모두 +극을 향해 출발하게 된다(Zwitter이온은 움직이지 않는다). 그런데 Glycine^-은 stacking gel의 낮은 pH에서 다시 평형을 이루어 일부가 zwitter이온이 되어버리기 때문에 이부분에서 움직이는 이온(mobile ion)이 없어지고, 결과적으로 전류가 감소하게 된다. 그러나 전체 gel 시스템의 전류는 유지되어야 하므로 이를 극복하기 위해 Cl^-이온과 glycine^-이온 사이에 매우 높은 전압차가 형성된다. 이때 상대적인 이동속도는 glycine^- < 단백질 < bromophenol blue < Cl^-이 된다(Cl^-는 작기 때문에 빠르고, 단백질은 glycine보다 크지만 음전하가 많아서 빠르다). 모든 단백질은 acrylamide 농도가 낮은 gel에서 움직임의 제한을 받지 않고 높은 전압차에 의해 빠르게 이동하지만, Cl^-이온 앞쪽이나 glycine^-이온 뒤쪽으로는 높은 전압이 없으므로 이 사이(얇은 disc)에 모두 모여 이동되는 셈이다. 이들이 resolving gel에 도달하면 이곳에서 glycine은 높은 pH로 인해 거의 모두 음전하가 되어 위와같은 효과는 사라지고, 또한 acrylamide의 농도가 높기 때문에 단백질은 크기에 따라서 분리가 시작되게 된다.

1) SDS-polyacrylamide gel의 준비

실험방법

* 실험재료
29% acrylamide, 1% bisacrylamide 용액
0.5 M Tris (pH 6.8), 1.5 M Tris (pH 8.8), 10% SDS, Water-saturated butanol
1x SDS gel-loading 완충용액 (50 mM Tris-Cl, pH 6.8, 100 mM dithiothreitol, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue, 10% glycerol): 6x로 만들어 쓰는 것이 편하다.
전기영동 완충용액 (25 mM Tris, 250 mM glycine pH 8.3, 0.1% SDS): 5x 또는 10x로 만들어두고 희석하여 사용하는데, 10x 용액은 Tris 30.2 g, glycine 188 g을 900 ml 증류수에 녹인 다음 10% SDS 용액을 100 ml 가하고 증류수로 1 liter까지 채워서 만든다.

1. 기구 제조회사의 조립설명에 따라 기구(Mighty)를 조립한다. Casting 되어 있는 유리판 사이에 comb을 미리 꼽아 보고 comb의 밑부분에서 약 1 cm 밑으로 선을 표시한다.

2. 표 2를 참고하여 Stacking gel과 running gel(10%)의 용액을 혼합한다. Mighty gel의 한판에 running gel 5 ml과 stacking gel 2 ml이 소요된다. (표 2 보기)

3. Comb을 제거하고 running gel 용액에 15 μl의 30% ammonium persulfate와 3 μl의 TEMED를 첨가한 후 거품이 나지 않을 정도로 신속히 섞고 pipette을 사용하여 조심스럽게 유리판 사이의 공간에 붓는다.

4. 가한 gel mixture의 높이가 미리 표시한 선까지 도달하면 증류수로 포화된 n-butanol을 조심스럽게 약 500 μl정도 가한다(이때 가하는 양은 정확하지 않아도 되며 n-butanol이 gel의 상부를 전부 덮으면 된다). Gel이 굳을 때까지 약 30분간 방치한다.

5. Gel이 굳으면 상층에 가한 n-butanol과 acrylamide사이가 뚜렷하게 구분되게 된다. 상층액인 n-butanol을 기울여서 버리고 증류수로 수차례 세척하고 filter paper를 사용하여 완전히 제거한다.

6. Stacking gel 용액에 7 μl의 30% ammonium persulfate와 2 μl의 TEMED를 첨가한 후 거품이 나지 않을 정도로 신속히 섞고 pipette을 사용하여 조심스럽게 유리판 사이의 공간에 붓고 comb을 설치한다.

7. Stacking gel이 굳는 동안 1x SDS gel-loading 완충용액이 들어 있는 시료를 100°C에서 3분간 가열하여 단백질을 변성시킨다.

8. Gel이 다 굳으면 조심스럽게 comb을 제거한 후 주사기의 증류수로 gel 형성이 안된 찌꺼기를 제거한다.

9. 굳힌 gel을 전기영동 기구에 장치하고 위와 아래 완충용액 통에 전기영동 완충용액을 붇는다.

10. Gel 홈에 시료를 가한다.

* 사용하지 않는 홈에도 시료와 같은 용량의 1x SDS gel-loading 완충용액을 가하는 것이 좋다.

11. 전기영동 기구를 전원에 연결시킨 후 gel의 전기장이 8 V/cm이 되게 전압을 건다.

12. Bromophenol blue가 resolving gel에 도달하면 15 V/cm으로 전압을 올리고 bromophenol blue가 resolving gel의 끝까지 갈 때까지 전기영동을 실시한다.

13. 전기영동이 끝나면 전기영동 장치로부터 유리판을 분리한 후 paper towel 위에 놓는다.

14. 유리판을 gel로부터 분리한 후 gel의 왼쪽 위 모서리에 표식을 남겨 방향을 알 수 있게 한다.

15. Gel을 고정하거나, Coomassie brilliant blue로 염색하거나, 형광사진의 촬영 또는 Western blot 등 용도에 따라 이용한다.

* Acrylamide와 bisacrylamide는 피부로 흡수되어 매우 강력한 신경독성을 나타내며 이 효과는 축적되기 때문에 무게를 잴 때는 장갑과 마스크를 차용해야 한다. 일단 굳은 polyacrylamide는 무해하다고 여겨지지만 polymer 형성이 안된 acrylamide 또는 bisacrylamide monomer가 남아 있을 수 있으므로 조심스럽게 다루어야 한다.

* Resolving gel과 stacking gel의 완충용액은 Tris 염으로 만드는 것이 중요하다. 증류수로 Tris를 녹인 후에는 용액의 pH를 반드시 맞춘 후 사용하여야 한다. 완충용액 제조시 Tris-HCl이나 Trizma를 사용하였다면 염의 농도가 너무 높아서 polypeptide가 비정상적으로 이동하여 널리 퍼진 띠모양을 형성하게 된다.

* TEMED(N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine)는 ammonium persulfate로부터 생기는 자유 반응기(free radical)의 생성을 촉매하여 acrylamide와 bisacrylamide의 polymer 형성을 촉진시킨다. TEMED는 자유염일 때에만 작용하므로 낮은 pH에서는 polymer 형성이 방해를 받는다.

* Ammonium persulfate는 자유 반응기를 생성하여 acrylamide와 bisacrylamide의 polymer를 형성시킨다. 증류수로 30%(w/v) 저장용액을 만들어 여과하고 작은 부피로 나눈 후 4°C에 보관하며, 시간이 지남에 따라 서서히 분해되므로 1~3주가 지나면 새로 만들어 사용하는 것이 좋다.

2) Coomassie brilliant blue로 SDS-polyacrylamide gel의 염색

실험방법

1. 0.25 g의 Coomassie brilliant blue R250을 10% acetic acid, 45% methanol 혼합용액(staining solution)에 녹인 후 덜 녹은 시약을 제거하기 위해 Whatman 1번 여과지로 거른다.

2. Gel을 적어도 5배 부피에 해당하는 염색액에 담근 후 염색이 충분히 될 때까지 서서히 흔든다.

3. 염색액을 제거한 후 염색약이 포함되지 않은 10% acetic acid, 45% methanol 용액(destaining solution)에 gel을 담가 두어 탈색시킨다.

4. 탈색용액을 여러차례 갈아 주면서 관찰한다. 보통 24시간 탈색을 하면 단일 띠로 0.01 mg의 단백질까지 찾아낼 수 있다.

5. 탈색 후 gel은 물이 담겨진 플라스틱 백에서 염색된 정도의 변화없이 무한정 보관할 수 있다. 그러나 저장기간 중 고정된 polyacrylamide gel은 물에 의해 부풀거나 변형될 수 있으므로 이러한 문제를 없애기 위해 고정된 gel을 20% glycerol이 들어 있는 물에 저장을 한다. 염색된 gel은 탈색용액에 저장하면 단백질 띠가 사라질 수 있으므로 탈색용액에 저장해서는 안 된다.

6. 영구적인 자료로 사용하기 위해 염색된 gel의 사진을 찍거나 gel을 말린 후 보관한다.

3) 은염(Silver salts)으로 SDS-polyacrylamide gel의 염색

SDS-polyacrylamide gel 전기영동에 의해 분리된 polypeptide를 은염으로 염색하기 위하여 여러가지 방법이 개발되었다. 그 방법은 모두 아미노산의 기능기에 결합하는 은 이온의 환원차를 이용한 것이다. 이들 방법은 암모니아를 처리한 은(ammoniacal silver) 용액을 사용하는 방법과 질산은(silver nitrate)을 사용하는 방법으로 크게 나눌 수 있다. 두가지 방법 모두 Coomassie blue에 비해 100에서 1,000배 예민하여 0.1∼1 ng의 polypeptide까지 단일 띠로 찾을 수 있지만 암모니아 처리은에 비하여 질산은의 경우가 제조하기가 더 쉽고 폭발성의 부산물을 만들어내지 않는다.

실험방법

* 실험재료
0.1% silver nitrate 용액: 잘 막힌 검은 갈색병에 들어 있는 20% 저장용액을 희석하여 새로 만들어 사용한다.
2.5% sodium carbonate, 0.02% formaldehyde 혼합 용액

1. Gel 부피의 최소한 5배되는 양의 10% acetic acid, 30% methanol 혼합용액에 gel을 담고 실온에서 4∼12시간 서서히 흔들어주면서 전기영동한 단백질을 고정시킨다.

2. 고정 용액을 버리고 최소한 5배 부피의 30% ethanol을 가한 후 실온에서 30분간 서서히 흔들어 준다.

3. 2번 과정을 한차례 반복한다.

4. Ethanol을 버리고 10배 부피의 증류수를 가한 후 실온에서 10분간 서서히 흔들어 준다.

5. 4번 과정을 한차례 반복한다. 이 과정에서 gel이 물에 의해 부풀 수 있다.

6. 증류수를 제거하고 장갑을 낀 후 gel의 5배 부피의 0.1% 질산은 용액을 부은 후 실온에서 30분간 서서히 흔들어 준다.

7. 질산은을 버리고 증류수로 gel의 양쪽 끝을 각각 20초씩 씻는다. 이 때 gel 표면이 마르지 않도록 주의한다.

8. 5배 부피의 새로 만든 2.5% sodium carbonate, 0.02% formaldehyde 혼합용액을 가한 후 실온에서 서서히 흔들어주면서 gel을 조심스럽게 관찰한다.

* 수분내에 염색된 단백질 띠가 나타나야 하며 원하는 대조가 얻어질 때까지 염색을 한다.
* Formaldehyde의 증기는 독성이 있으므로 이를 포함하는 용액은 hood에서 만들어야 한다.
* 염색 시간이 길면 gel 자체가 염색되며 배경이 좋지 않다.

9. 수분동안 1% acetic acid를 가하여 반응을 끝내고 gel을 증류수에 10분씩 여러차례 세척한다. 때때로 반짝이는 회색의 은막이 gel 표면에 형성되며 이것은 4배 희석된 사진 현상용액에 2∼3초 세척함으로써 쉽게 제거될 수 있다.

10. Gel을 말려 보관한다.

* 참고사항

사진 현상 용액은 다음과 같이 제조한다.
1) 용액 A: NaCl 37 g과 CuSO₄ 37 g을 850 ml 증류수에 녹인다. 짙은 푸른 침전이 생긴 후 다시 녹을 때까지 농축 암모니아를 가한 후 부피를 1 liter로 희석한다.
2) 용액 B: Sodium thiosulfate 436 g을 증류수에 녹여 1 liter로 만든다.
3) 같은 부피의 용액 A와 B를 혼합한 후 혼합용액의 3배 부피 증류수에 희석한 다음 즉시 사용한다.

4) SDS-polyacrylamide gel 말리기

[³⁵S]로 표시된 단백질을 포함하고 있는 SDS-polyacrlamide gel은 자가방사법에 의한 사진을 얻기 위해 반드시 먼저 말려야 한다. Gel을 말리는 과정에서의 어려운 점 두가지는 gel이 쪼그라들면서 변형되는 것과 금이 가는 것이다. Gel을 말리기 전에 Whatman 3MM 종이에 부착시킴으로써 gel이 쪼그라드는 것을 방지할 수 있으나 금이 가는 것을 방지할 수는 없다. Gel이 polyacrylamide를 많이 함유하고 두꺼울수록 갈라짐이 심해지므로 진공 압력의 변화가 적은 좋은 품질의 gel 건조기를 사용하여야 하며 가능한한 얇은 gel을 사용하도록 한다. Gel이 갈라지는 것은 gel 건조기에서 수분이 완전히 제거되기 전에 gel을 건조기에서 꺼내는 경우 잘 일어나므로 주의를 요한다.

1. Gel을 전기영동 기구에서 떼어낸 후 실온에서 5∼10배 부피의 10% acetic acid, 30% methanol 혼합용액에 고정시킨다.

* Bromophenol blue는 산성 고정 용액에서 노란색으로 변하여 gel에 퍼지게 된다. 처음색이 완전히 사라진 후 5분 정도 고정액에 놓아둔 후 gel을 증류수에 세척한다.

2. Gel보다 약간 더 큰 비닐 랩 위에 gel을 놓고 오른쪽 아래 모서리에 표시를 한다.

3. 습기가 있는 gel 위에 Whatman 3MM 종이를 놓는다. 종이는 gel의 가장자리보다는 약간 더(1∼2 cm) 크고 gel 건조기보다는 작게 준비를 한다.

* Gel에 한번 붙은 3MM 종이를 다시 움직이게 하면 안된다.

4. 다른 3MM 종이를 gel 건조기의 표면에 올려놓는다. 이때 종이는 gel 전체를 올려놓기에 충분하게 준비를 한다.

5. 2∼3 번에서 준비한 3MM 종이/gel/비닐랩을 포개어 건조기의 3MM 종이 위에 놓는다. 이때 비닐랩이 제일 위에 위치하도록 한다.

6. 건조기의 덮개를 덮어 진공이 완전히 걸리게 한다. 건조기에 전열기가 달려있는 경우 gel을 빨리 말리기 위하여 50∼80°C로 가열한다.

7. 건조기의 제작사에서 권장하는 시간동안 gel을 말리며(보통 0.75 mm 경우 2시간) 가열하면서 말릴 경우에는 진공을 풀기 수분전에 가열을 중지하여야 한다.

8. 3MM 종이에 달라붙은 gel을 건조기로부터 분리해 낸다.

9. 비닐랩을 제거한 후 자가방사하기 위해 암실에서 필름에 감광시키거나 실험자료로 보관한다.