Probe 제조에 이용되는 방사성 동위원소

1) ³H

specific activity가 가장 낮다. 반감기가 길다(12년). 방출되는 energy가 낮아 자가방사법에 사용되기는 어렵고 in situ hybridization 등에 이용된다.

2) ³²P

가장 보편적으로 사용된다. 반감기가 짧다(14일).β-입자를 방출하여 가장 높은 specific activity를 가진다.

3) ³⁵S

³²P보다 energy가 적고 specific acitivity가 낮다. 반감기는 87일이다.

핵산에 방사성 동위원소를 표식하는 방법

1) 핵산 전체를 균일하게 표식하는 방법

Nick translation
Random oligonucleotide primer를 이용한 방법

2) 5'-말단이나 3'-말단을 표식하는 방법 (End-labeling 방법)

Kination(end-labeling)
Filling-in(end-filling)

이중 nick translation은 이제 잘 쓰이지 않는다.

방사성 동위원소가 표식된 probe의 용도

1) cDNA 혹은 genomic DNA library로부터 특정한 clone을 찾아낼 때 흔히 방사성 동위원소로 표지된 oligonucleotide나 cDNA probe를 사용하여 colony 혹은 plaque hybridization에 이용한다.
2) Genomic DNA의 특정 부위의 배열을 밝히기 위하여 cloning된 DNA의 일부를 probe로 하여 Southern hybridization을 시행한다.
3) 실험실에서 분리한 RNA에 특정 RNA가 포함되어 있는지, 포함되어 있다면 그 크기와 양은 어떠한지를 밝히기 위하여 cloning된 DNA의 일부를 probe로 하여 Northern hybridization을 시행한다.

A. Random primer를 이용한 DNA probe의 제조

DNA의 생합성은 단일가닥의 template에 결합된 primer로부터 DNA polymerase에 의해 시작된다. 만일 primer가 동일한 것이 아니고 여러종류가 섞여있을 경우 이들은 template의 여러부위에서 hybrid를 형성하게 되고 결과적으로 template의 모든 nucleotide가 동일한 빈도로 합성되어 복제되게 된다. 이 방법에 의하여 [α-³²P]dNTP를 전구물질(precursor)로 사용하여 DNA에 매우 높은 specific activity로 동위원소를 표지할 수 있다. 최근에는 비방사성 원소를 사용하여 DNA 혹은 RNA를 표식하는 방법이 개발되어 많이 사용되어지고 있다.

실험방법

* Random primer를 다음 3가지 방법으로 얻을 수 있다.

1) Calf thymus 혹은 salmon sperm DNA를 DNAase I으로 절단하여 6∼12 nucleotides 크기의 단일가닥의 DNA를 얻을 수 있다.
2) 상업적으로 제조 판매되는 calf thymus DNA로부터 제조된 random primer를 구할 수 있다.
3) DNA 합성기를 사용하여 4가지 염기를 모든 위치에 동일한 빈도로 함유한 oligomer를 제조할 수 있다. 이렇게 합성된 oligomer는 길이가 일정하고 염기 서열상의 불균일성도 배제할 수 있어 방사성 동위원소 표지 방법에 가장 좋은 선택이 될 수 있다.

* 사용되는 DNA polymerase는 template에 따라 다르다. RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase, 역전사효소)는 단일가닥의 RNA template로부터 probe를 제조할 때 쓰이며 Klenow enzyme은 template가 단일가닥의 DNA일 경우 사용된다. Probe는 5x10⁸ 내지 4x10⁹ cpm/μg의 specific activity를 나타내게 된다.

* 실험재료
10x 반응완충용액 (900 mM HEPES, pH 6.6, 100 mM magnesium chloride 및 random primer함유)

1. 이중가닥의 DNA 50 ng과 증류수를 넣어 9 μl로 만든 후 100°C에서 10분 동안 둔다.

2. 중탕이 끝나면 즉시 얼음물로 옮겨 1분이상 냉각시킨다.

3. 여기에 dATP, dGTP, dTTP(각 1 mM 농도) 혼합용액 3 μl, 10x 반응완충용액 2 μl, [α-³²P]dCTP 5 μl(10 mCi/ml, specific activity가 3000 Ci/mmole 이상일 것)를 가한다.

4. 2 units(1 μl)의 Klenow fragment (Klenow enzyme)를 첨가하고 pipette으로 수차례 섞은 후 수초간 원침시켜 미세원침관의 모든 용액을 바닥에 모이도록 한다.

5. 37°C에서 30분 동안 반응시킨다.

6. pH 8.0인 0.5 M EDTA 용액 2 μl를 첨가하여 반응을 중지시킨다.

7. DNA 합성에 이용되지 않은 unlabeled isotope은 이후의 여러 실험에서 좋지 않은 영향을 줄 수 있으며, 제거하는 것이 좋다. Spin column을 이용한 Sephadex G-25나 Biogel P6 등으로 제거하도록 한다. Hybridization에 이용하기 전에 반드시 끓여서 denature시키도록 한다.

B. Kinase를 이용한 end-labeling

DNA 조각의 한쪽(5' 또는 3'쪽)끝에 동위원소를 표지하는 방법을 end-labeling이라 하는데 이중 kinase 효소를 이용하여 [γ-³²P]ATP를 5'쪽 phosphoryl기에 치환시키는 방법을 kination이라 한다. 이 방법은 single strand DNA에도 적용될 수 있어 synthetic oligonucleotide를 이용하는 경우에도 쓸 수 있다. T4 polynucleotide kinase의 활성은 DNA의 5'쪽의 형태(protruding-end, blunt-end, recessive-end)에 따라 다르게 나타나므로 가능하면 활성이 높은 protruding-end를 이용할 수 있도록 실험을 디자인해야 한다.

실험방법

1. 미세원침관에 동위원소를 표지할 DNA 조각 0.5 μg과 10x kinase 완충용액(500 mM Tris-HCl pH 7.4, 100 mM magnesium chloride, 50 mM dithiothreitol) 2 μl를 넣는다.

2. [γ-³²P]ATP 3 μl(30 μCi: specific activity가 3000 Ci/mmole 이상일 것)를 첨가한 후 증류수를 첨가하여 19 μl로 만든다.

3. T4 polynucleotide kinase 1 μl(10 units)를 첨가하고 잘 혼합한 후 미세원침관을 간단히 원심분리한다.

4. 37°C에서 45분간 kination 반응이 일어나도록 보관해 둔다.

5. 90°C로 2분간 가열한 후 -20°C에 보관한다.

C. Klenow 효소를 이용한 end-filling(filling-in)

Filling-in이란 Klenow 효소를 이용하여 3'-쪽 끝에 방사능을 지닌 DNA를 만들어 주는 방법이다. 제한효소를 사용하여 5'-overhang이 된 DNA에 방사능을 지닌 한가지(보통 dCTP)의 염기와 방사능을 지니지 않은 세가지 염기를 첨가하여 Klenow 처리하면 표지된다. 이 방법은 자신이 원하는 부분에 정확히 표지할 수 있는 장점이 있지만 random primer를 이용한 경우보다 표지되는 동위원소의 수가 적기 때문에 DNA 몰수 당 specific activity가 적다는 단점이 있다. DNA 두가닥 중 한 가닥에만 특이적으로 표지해야 하는 DNase I footprinting이나 Maxam-Gilbert sequencing에 이용하는 probe는 이 방법을 이용할 수 있다.

실험방법

1. 미세원침관에 동위원소를 표지할 DNA 조각 1 μg과 2 mM dNTP 1 μl 및 10x Klenow 완충용액 2.5 μl를 넣는다.

2. [α-³²P]dCTP(3,000 Ci/mmole 이상일 것)를 3 μl (30 μCi) 첨가한다.

3. Klenow 효소 1 unit를 넣고 증류수를 첨가하여 총부피 25 μl로 만든 다음 손끝으로 조심스럽게 잘 섞고 간단히 원심분리한다.

4. 상온에서 30분간 반응시킨다.

5. pH 8.0인 0.5 M EDTA 2 μl를 첨가하여 반응을 중지시킨다.