>>Plaque hybridization
Genomic DNA library란 수많은 종류의 유전자를 함유하고 있는, 문자 그대로 유전자를 모두 가지고 있는 유전자 도서관이라고 할 수 있다. 즉 조그마한 1.5 ml 크기의 microcentrifuge tube에 담겨 있는 genomic DNA library 용액내에는 수백만가지의 서로 다른 유전자를 함유한 vector가 섞여 있는 것이다. 이 library에서 우리가 원하는 특정 유전자를 함유하고 있는 vector를 선별하여 한가지 종류의 유전자만을 함유하는 - 단일한 종류의 - vector를 보유하게 되는 일련의 과정이 gDNA cloning이다. 본 장에서는 흔히 genomic DNA cloning에 사용되는 phage vector로 제조된 genomic DNA library에서 특정 유전자를 cDNA를 probe로 하여 cloning하는 방법을 screening을 중심으로 설명하도록 한다.
A. ATP-citrate lyase 유전자의 screening
실험방법
* 실험재료
Phage plating bacteria: E. coli K802 strain
20% Maltose(sterilized by filtration through 0.2 μm pore size filter)
LB soft top agarose: LB 배지에 20 mM MgSO4를 넣고 0.75% agarose를 첨가한 후 microwave oven에서 가열하여 녹인다. 48°C가량 식으면 0.2% maltose가 되도록 첨가한 후 사용한다.
Denaturing solution(1.5 M NaCl, 0.5 N NaOH)
Neutralizing solution(1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-Cl, pH 8.0)
1x Lambda dilution buffer(0.1 M NaCl, 10 mM MgSO4, 0.1 M Tris-Cl, pH 7.5)
1) Phage plating 세포의 준비
Phage가 박테리아에 infection되는 효율을 높이기 위해서는 사용되는 박테리아의 준비가 비교적 중요하다. 즉 phage growth에 사용될 박테리아는 배양과정중 logarithmic growth phase에서 얻어져야 하고 죽은 세포는 없어야 한다. 이는 처음 library를 직접 제조하여 원액 등을 만들었을 경우 추천되는 방법이다(상업적으로 판매되는 library construction kit의 protocol은 이 방법을 제안한다). 일반적으로 screening을 위한 plaque hybridization이나 phage DNA를 분리하기 위하여 infection시킬 plating 세포(박테리아)를 준비할 경우 반드시 logarithmic growth phase의 세포를 얻을 필요는 없는 것으로 생각된다. 본 실험실에서 실험한 결과 다음 방법으로 간단하게 plating 세포를 준비할 수 있으며 큰 문제점이 제기된 경우는 없었다.
1. Infection 시키고자하는 날보다 2일 전에 plating 세포(E. coli K802)를 보관했던 glycerol stock에서 LB agar plate에 streak하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
2. Infection 시키고자하는 전날 오후에 agar plate에 자란 하나의 colony를 취해서 10 mM MgSO4와 2% maltose가 함유된 LB 배지 10 ml(50 ml cornical tube를 사용)에 접종한 후 37°C shaking incubator에서 하룻밤 동안 배양한다.
3. 배양이 끝난 세포를 얼음속에서 약 10분간 방치한 후 4,000 rpm으로 4°C에서 10분간 원심분리한다.
4. 상층액을 제거한 후 미리 4°C로 차게한 10 mM MgSO4 10 ml에 resuspend시킨 후 냉장보관한다. 이 박테리아는 즉시 phage infection에 사용할 수 있다. 이렇게 준비한 plating 세포는 약 1주일간 사용할 수 있으며 더이상 보관 기간이 길어지면 infection 효율이 현저하게 감소한다. 즉 되도록이면 필요할 때마다 신선하게 준비하여 사용하는 것을 권장한다.
2) cDNA를 probe로 사용한 library screening
1. 15 ml cornical tube에 준비된 phage plating 세포를 200 μl 씩 분주한다.
2. Infection 시키고자하는 phage의 숫자를 함유하는 희석된 library 용액을 준비한다.
* 90 mm plate일 경우 10,000 pfu, 150 mm plate의 경우 30,000 pfu의 phage를 infection시켜 agar plate에서 배양한 후 screen할 수 있다. 이 이상의 숫자로 infection시킬 경우 screening이 어려워진다. 또한 세포의 양도 150 mm plate의 경우 500 μl를 사용하여야 한다. Infection 시키는 phage 용액은 1x lambda dilution buffer에 희석되어야 하며 용량은 phage plating 세포량의 1/2이 되도록 한다.
3. Phage plating 세포가 담겨 있는 cornical tube에 100 μl의 phage 용액을 가하고 잘 섞은 후 37°C에서 15분간 방치한다.
4. 48°C로 온도를 맞춘 10 mM MgSO4가 함유된 LB top agarose를 4 ml 가하고 거품이 생기지 않도록 주의하며 잘 섞은후 즉시 90 mm LB plate에 부어 고루 퍼지게 한 후 수평판위에서 약 10분간 방치한다.
5. Plate를 37°C 배양기에서 6시간 내지 10시간 동안 배양한다.
* Phage가 infection되어 형성된 plaque는 약 5시간 이후부터 보이기 시작한다. 배양시간은 형성되는 plaque의 상태에 따라 결정하여야 한다. Plaque의 크기가 너무 작아도 hybridization signal이 약할 수 있고 너무커서 인접한 plaque와 완전히 섞여버려도 selection이 어려워진다. Plaque끼리 서로 인접하여 bacterial lawn이 드믄드믄 남아 있을 정도로 배양하도록 한다.
6. Hybridization에 사용할 nylon membrane을 덮기 위하여 4°C에서 최소한 30분이상 방치하도록 한다.
3) Filter replica의 준비
1. Nylon membrane(82 mm diameter)에 볼펜이나 연필로 번호를 써서 plate표시를 한다.
2. Nylon membrane을 plate의 한쪽부터 조심스럽게 덮는다. 이때 nylon membrane과 plate의 top agarose사이에 기포가 생기지 않도록 주의한다.
3. 21G 주사바늘을 사용하여 membrane의 3군데에 비대칭적으로 구멍을 뚫은 후 plate의 뒤쪽에 그 위치를 표시한다.
4. 1분간 방치한 후 끝이 편편한 핀셋(Milipore)을 사용하여 membrane을 떼어낸다.
* 이때 top agarose가 membrane에 붙어 같이 떨어지지 않도록 조심한다.
5. 떼어낸 mambrane을 denaturing solution에 plaque가 붙어 있는 쪽이 위로 가도록 하여 30초 동안 floating시키고 1분간 용액에 잠기도록 한다.
6. 5분 동안 neutralinzing solution에 담가 방치한다.
7. 수초간 3x SSC에 담가 rinsing한 후 filter paper 위에 놓고 건조시킨다.
8. 두번째 nylon membrane을 동일한 plate에 덮고 과정 2, 3과 같이 표시한 후 3분간 방치한다.
9. 첫번째 membrane의 경우와 동일한 방법으로 진행한다.
10. 건조된 membrane은 UV-cross linker에서 1,200 count(120,000 μjoule)로 DNA를 고정시킨다.
11. 준비된 nylon membrane은 4°C에 건조된 상태로 보관할 수 있으며, 동위원소로 표지된 cDNA probe와 hybridization을 시행한다. 이 이하의 과정은 Southern blot 실험에서와 동일한 방법으로 시행한다.
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