실험방법

1. Chamber slide를 사용하여 세포를 배양한다. Chamber slide가 없을 경우 slide glass나 cover slip을 autoclave하여 culture dish에 넣고 세포를 배양한다.

2. Chamber slide의 경우 slide와 chamber를 분리한 후 slide를 phosphate buffered saline(PBS)으로 세척한다. 사용하는 발색효소가 alkaline phosphatase일 경우 tris-buffered saline(TBS)을 사용한다. Slide의 한쪽면을 휴지에 대고 기울여 물기를 제거한다. 이때 slide가 완전히 마르지 않도록 조심한다.

3. 새로 만든 아세톤-메탄올 혼합액(1:1)에 slide를 2분간 담구었다가 꺼낸다음 5번 단계로 넘어간다.

4. 즉시 실험을 못할 경우 slide를 공기중에서 완전히 말린 다음 -70°C 냉동고에 넣어 보관한다. 보관 후 다시 실험을 할때에는 dry ice로 미리 차게해 놓은 아세톤-메탄올 혼합액(1:1)에 slide를 넣은 후 상온으로 옮겨 서서히 온도가 올라가게 한 다음 5번을 진행한다.

5. 아세톤-메탄올 혼합액을 제거한 후 PBS(TBS)로 slide를 세척한다.

6. Slide의 염색할 부위에 oil pen(DAKO pen)으로 테두리를 친다.

7. 정상 토끼혈청을 테두리 친 영역에 몇 방울 떨어뜨려 30분간 blocking 한다.

8. 토끼혈청을 제거한 후 대상 항원에 대한 항체(1차 항체)를 몇방울 떨어뜨린 후 1시간(sensitivity를 증가시키기 위해 overnight까지 두기도 함) 방치한다. 1차 항체로는 monoclonal antibody가 많이 사용되며, 그외 ascitic fluids, polyclonal antibody를 사용할 수 있다. 일반적으로 상용으로 구입한 monoclonal antibody의 경우 설명서에 제시한 농도로(보통 1-10 μg/ml) 희석하여 사용하면 되고, 이것이 불확실할 경우(특히 직접 만든 polyclonal antibody같은 경우) 1/10, 1/100, 1/1,000, 및 1/10,000의 희석액으로 시험해보는 것이 좋다. 희석은 3% bovine serum albumin(BSA)이 녹아있는 PBS(TBS) 용액을 사용한다.

9. 1차 항체를 제거한 후 PBS(TBS)로 3번 세척한다.

10. 2차 항체를 몇 방울 떨어뜨린 후 30분간 방치한다. 2차 항체는 1차 항체가 mouse antibody인 경우 anti-mouse antibody를, 1차 항체가 rabbit antibody인 경우 anti-rabbit antibody를 선택한다. 2차 항체로는 효소가 붙어 있는 2차 항체를 사용할 수 있으나 보통 sensitivity를 증가시키기 위해 biotin이 붙어있는 2차 항체를 사용하고 avidin에 효소가 붙어있는 3차 시약을 다시 첨가한다. 항체나 avidin에 붙이는 효소로는 주로 alkaline phosphatase나 horseradish peroxidase가 사용된다.

11. 2차 항체를 제거한 후 PBS(TBS)로 3번 세척한다.

12. Avidin-enzyme 3차 용액을 몇방울 떨어뜨린 후 30분간 방치한다.

13. 3차 용액을 제거한 후 PBS(TBS)로 3번 세척한다.

14. 기질용액으로 발색시킨다. Horseradish peroxidase의 경우 diaminobenzidine(DAB)/metal, chloromaphthol, aminoethylcarbazole(AEC)등을 사용하며, 각각 gray-black, blue-black, red의 색을 낸다. Alkaline phosphatase의 경우 Naphthol-AS-BI-phosphate/New Fuchsin(NABP /NF)와 Bromochloroindolyl phosphate/nitrobluetetrazolium(BCIP/NBT)를 기질로 사용하며, 각각 red 와 black-purple의 색을 낸다. 여기서는 horseradish peroxidase와 DAB을 이용한 방법을 설명하겠다.

15. 6 mg DAB를 0.9 ml의 0.05 M Tris 완충용액에 녹인 후 1 ml의 0.3%(w/v) nickel chloride와 0.1 ml의 3% H₂O₂를 더하여 specimen에 떨어뜨린 후 1~20분간 놓아둔다.

16. 증류수로 세척한다.

17. 필요한 경우 counter staining을 한다.

18. 75% ethanol에 1분, 95% ethanol에 1분, absolute ethanol에 1분간 담가둔다.

19. Xylene에 1분간 담가둔다.

20. Mounting을 한다.