A. Cell culture에 필요한 장비들

1) 고정 장비류

1. Culture bench - laminar flow, UV lamp, flaming apparatus
2. CO₂ incubator - 온도, CO₂ level, 및 습도 조절 가능한 것
3. Microscope
4. Filtering apparatus
5. Vacuum pump 와 suctioning apparatus

2) 일회성 장비 및 시약류

1. Cell culture medium, serum, antibiotics, NaHCO₃(모두 cell culture grade 제품으로 구입한다)
2. Culture flask or dishes
3. PBS (cell culture grade)
4. Trypsin 혹은 Trypsin-EDTA
* BRL사의 Trypsin-EDTA는 0.5% trypsin, 5.3 mM EDTA으로 판매되며 이를 PBS로 10배 희석하여 1x Trypsin-EDTA로 사용한다.
5. Medium Bottle - autoclave 가능한 유리제품
6. Disposable pipette 혹은 glass pipette 및 pipette aid
7. Pasteur pipette(suction 장치에 연결하여 사용)
8. 70% ethanol(살균용, 분무기에 넣어 사용)
9. Hemocytometer 및 cell counter

B. Medium 제조

Cell culture용 medium은 액체상태로 판매되는 것이 있고, powder로 판매되는 것도 있다. 흔히 powder 형태의 것을 구입해 물에 녹인 후 filtering하여 제균하고 serum과 항생제 등을 첨가하여 사용한다. 사용하는 모든 시약들은 cell culture grade의 제품을 사용하여야 한다.

실험방법

DMEM 제조를 예로 들어 설명한다.

* 실험재료
DMEM powder 1 pack
Sodiun Biocarbonate powder(NaHCO₃)
Antibiotics(BRL)
Fetal calf serum(FCS)
1.0 N NaOH 및 1.0 N HCl(cell culture 용)
Bottle top filter 혹은 이에 해당하는 filtering 장치
멸균한 500 ml bottle 2개

1. DMEM 1 pack을 3.7 g의 NaHCO₃와 함께 4차 증류수 1 liter에 녹인다.

2. Stirring 하여 완전히 녹인 후 NaOH와 HCl을 이용하여 pH 7.2 로 맞춘다. 원래 cell 생육을 위한 pH는 7.4 이지만 filtering을 거치게 되면 0.2 정도 pH가 상승하기 때문이다.

3. Filtering 장치를 culture bench 안에 setting하고 무균적인 조건을 유지하면서 2의 DMEM을 filter한다.

4. 멸균해 놓은 bottle에 2개에 450 ml 씩 나누어 담고 남은 100 ml의 medium은 sterile한 cornical tube에 보관하였다가 transfection 등 serum free medium이 필요할 때에 사용한다.

5. 450 ml에 FCS 50 ml, antibiotics 5 ml를 첨가하고 label 한 뒤 4°C에 보관한다.

Serum inactivation

Serum은 사용하기 전에 inactivation 이라는 전처리를 하는 경우가 있다. Serum을 56°C 에서 30분 동안 가열하여 serum 속에 존재하는 항체 및 complement를 불활성화 시키는 것이다. 특정한 몇몇 cell 들은 serum inactivation이 반드시 필요하다고 하나, 많은 경우에 있어서는 반드시 필요한 것이 아니며 inactivation 과정 중 단백질 변성이 있을 수 있으므로 꼭 필요한 경우가 아니면 생략해도 좋겠다. Serum은 50 ml 씩 cornical tube에 나누어 놓고 -20°C에 보관하였다가 한 개씩 사용하면 편리하다.

Inactivation 방법

1) 냉동상태의 serum이면 먼저 상온에서 완전히 녹이고, water bath는 56°C로 맞추어 놓는다.
2) serum 이 들어있는 용기와 같은 용기에 증류수를 500 ml 채우고 온도계를 설치한다. 이 증류수 병과 serum bottle을 함께 water bath에 담근 후 증류수가 56°C 될 때부터 30분간 water bath에 방치한다.
3) Clean bench에서 50 ml씩 sterile cornical tube에 나누어 담고 냉동 보관한다.

C. Cell Plating

Established cell line의 경우 대개는 ATCC(American type culture collection)에서 구입하게 된다. 주문한 cell은 storage vial에 담겨 얼어있는 상태로 dry ice와 함께 포장되어 배달되는데, 이를 지체하지 않고 ATCC에서 지시하는 적당한 growth medium에 suspension 하여 culture를 시작한다. 적절한 serum, 항생제 및 그밖의 성분을 첨가한 growth medium을 제조하고 사용하기 30분 전에 미리 37°C water bath에 담가 두어 medium의 온도를 37°C가 되게 준비한다. 받은 cell storage vial 을 floating rack에 끼우거나 뚜껑 부분을 손으로 잡고 37°C water bath에 잠시 담가 녹인다. 녹기 시작하면 즉시 꺼내서 cell culture bench로 가지고 와서 10 cm culture dish에 medium을 10 ml 넣고, Pasteur pipette 이나 bluetip 등 끝이 뾰족한 pipette을 이용하여 vial 속의 내용물을 옮기고 suspension한다. Culture flask를 사용할 경우에는 뚜껑을 완전히 잠그지 않도록 주의한다. 뚜껑을 헐겁게 닫아 incubator 내에서 CO₂ exchange가 용이하도록 하여야 한다. 이를 incubator에 넣고, 다음날 아침 현미경으로 관찰하여 cell들이 바닥에 붙어있음을 확인하고 새로운 medium으로 바꾸어준다.

D. Cell Maintaining

바닥에 붙어있는 cell들은 분열을 하여 서서히 자라며, 성장속도는 cell line의 종류에 따라 다르다. Cell의 성장에 필요한 영양소 및 성장인자 등은 medium으로부터 공급 받으므로, 2 내지 3일 간격으로 새로운 medium으로 바꾸어준다. 또한 적당한 시간 간격을 두고 cell을 떼어 여러 개의 dish에 나누어 다시 키우는 subculture를 한다. Cell line의 종류에 따라 contact inhibition(cell population이 너무 커져서 cell과 cell 이 조밀하게 맞닿을 경우 cell 성질에 변화를 주고 성장이 방해 받는 현상)을 심하게 받는 것과 그렇지 않은 것이 있는데, NIH3T3 등의 contact inhibition 이 심한 종류의 경우 confluent 상태가 되기 전에 subculture해 주어야 하며 여러 가지 cancer cell line 등 contact inhibition을 심하게 받지 않는 종류들은 culture 용기에 confluent해 지면 subculture한다. Cell 종류에 따라 다르겠지만 대략 1주일 간격으로 subculture를 하는 것이 일반적이다. 이렇게 cell culture 도중 한 culture vessel에서 다른 culture vessel로 옮긴 횟수를 passage number 라는 용어로 나타내며 passage가 너무 여러번 지난 cell은 본래의 성질을 잃어버리는 경우가 있으므로 실험에 사용하지 않는 것이 좋다.

실험방법

1. PBS(phosphate buffered saline)와 medium, 그리고 1x trypsin-EDTA 를 37°C water bath에 담가 놓는다.

2. Culture medium을 모두 suction해 내고 PBS 5 ml를 가한다. 뚜껑을 덮고 dish를 살짝 흔든 후 PBS를 suction으로 제거한다. 이같은 PBS washing을 한번 더 반복한다. 두 번의 PBS washing으로 남아있는 medium및 serum을 모두 제거하고자 함이다.

3. 37°C 의 trypsin-EDTA solution을 소량 가하여 dish의 표면이 모두 덮이게 한다. 10 cm dish를 기준으로 대략 0.5 내지 1 ml 정도면 dish를 모두 덮을 수 있는 양이 된다.

4. 뚜껑을 덮고 37°C culture incubator에 잠시 방치한다. 이때 cell의 종류에 따라 바닥에서 detach 되는데 걸리는 시간이 다르므로 수시로 확인하여 너무 오랫동안 방치하지 않도록 주의한다. Cell이 detach 되는 것은 육안으로 확인할 수 있으므로 확인이 되면 즉시 bench로 가지고 온다.

5. Medium을 5 내지 10 ml 넣고 50 ml cornical tube 로 옮긴 후 pipette으로 몇 번 up and down 하여 cell 이 single cell 들로 잘 분산될 수 있도록 한다.

6. 여기에 35 ml의 medium을 가하고 다시 한번 잘 섞어준 다음 4개의 새로운 10 cm dish에 10 ml씩 나누어 넣는다. 이것은 4개로 나누어 subculture 할 경우를 예로 든 것이다. Subculture ratio는 1:2 에서 1:20 이상까지 cell의 종류에 따라 매우 다르므로 용도와 경우에 따라 다르게 조정하면 된다. (Medium 함유된 serum에는 trypsin을 inhibition하는 성분들이 있으므로 trypsin을 굳이 제거할 필요는 없으나 serum free medium이나 low serum medium을 사용해야 하는 경우에는 위의 5번 단계에서 원심분리하여 trypsin을 제거하는 것이 바람직하다. 원심분리는 약 200 xg 정도에서 2분 정도 약하게 원심분리하면 cell이 cornical tube의 바닥에 가라앉은 것을 볼 수 있다. Medium을 suction해 내고 culture에 사용할 medium을 5 ml 정도 넣고 pipette으로 suspension한 다음 6번 과정을 진행한다.)

7. 37°C incubator에서 6시간 정도 경과하면 cell이 바닥에 붙게 되는데 이때 새로운 medium으로 바꾸어 trypsin을 제거한다. 대개의 경우는 다음날 medium을 교환 한다.

E. Cell Strage

Subculture를 반복하다 보면 cell 이 본래의 성질을 잃거나 contamination 되는 경우가 있다. 이때는 미리 저장해 놓았던 cell을 꺼내어 다시 plating하고 culture 해야 한다. 또한 구입한 cell 이나 특별한 목적을 가지고 제조한 stable cell line 등을 다음에 다시 실험하기 위해서도 cell들을 저장해두는 과정은 매우 중요하다. 저장하는 cell들은 반드시 건강한 상태로 자라고 있던 것이어야 한다. 너무 confluent 하거나 건강하지 않은 morphology를 보이는 것을 저장하면 viability가 좋지 않다. 또한 contamination 여부도 철저히 확인한 후 저장해야 한다. Cell을 오랫동안 보관하기 위해서는 흔히 초저온 저장법(cryogenic storage)을 사용한다. 이는 -130 °C 이하의 저온이 유지되는 freezer에 cell을 보관하는 방법으로, 대개 액체 질소 tank를 사용한다. Freezing process 중 급격한 동결에 의한 cell 의 damage를 최소화하기 위해 DMSO나 glycerol 등의 cryoprotective agent 를 반드시 첨가해주어야 한다. DMSO는 최종 volume의 5 내지 10%, glycerol은 최종 volume의 5 내지 15% 이 되도록 첨가하는데 적정 사용량은 cell line에 따라 다르다.

실험방법

1. 저장하려는 cell은 하루 전에 medium을 갈아준다.

2. Growth medium과 PBS, serum, 그리고 DMSO를 37°C water bath에 담가 놓는다.

3. Medium: Serum: DMSO = 7: 2: 1 이 되도록 미리 혼합해 놓는다. 저장용 vial 한 개에 들어가는 volume은 1 ml 이므로 저장하고자 하는 개수에 맞추어 준비한다. (예를 들어, 10cm dish 한 개에 자란 NIH3T3 cell을 저장하고 한다면 약 3개 정도로 나누어 저장하므로 Medium 2.1 ml, serum 0.6 ml, DMSO 0.3 ml 를 혼합하면 된다)

4. PBS washing 2회, 및 trypsin 처리까지의 과정은 위의 cell maintaining의 2~5과정과 같다.

5. 200 xg에서 2분간 원심분리하고 상층액을 suction하여 trypsin이 함유된 medium을 완전히 제거한다.

6. 준비해놓은 3의 solution을 가하여 pipette으로 잘 부유 시키고 미리 날짜, cell line 명, passage No. 등을 확실하게 표기해 놓은 cell storage vial에 1 ml 씩 나누어 담는다. Labeling은 연필로 하는 것이 지워지지 않아 좋으며 vial의 공간은 2 ml 이상이 들어갈 수 있으나 1 ml 이상 담지 않도록 한다. 저온저장을 하는 과정 중 부피가 팽창하게 되기 때문이다.

7. 준비된 vial 들을 서서히 (-1°C/min) 냉동 시키는 것이 매우 중요하다. Programmable freezer를 사용할 수 있으면 바람직 하나 그렇지 못할 경우 두께가 1.5 cm 내지 2 cm 되고 뚜껑이 있는 두꺼운 스티로폼 용기에 vial들을 넣고 뚜껑을 닫은 후 -70 내지 -90°C 의 deep freezer에 넣어둔다. 이렇게 하면 서서히 냉동되는 효과를 얻을 수 있다. 다음날 vial 들을 꺼내어 최종적으로 보관하는 장소인 액체 질소 tank로 옮긴다. 옮기는 동안에도 신속히 진행하여 온도가 높아져 녹거나 하는 일을 없도록 주의한다.

F. Transfection

DNA를 culture 중인 cell 내로 유입시켜 외부 DNA가 세포 내에서 발현되도록 하는 것이 transfection의 목적이다. DNA는 negative charge를 띄는 분자이고 cell membrane 또한 negative charge를 띈다. 따라서 DNA를 cell 속으로, 더구나 핵 속으로 까지 유입 시키는 것은 여러 가지 특별한 agent를 통한 transfection method를 사용해야 하는 까다로운 일이며, 높은 tranfection efficiency를 얻는 것이 모든 실험의 관건이다.

DNA를 cell 내로 유입 시키는 방법은 크게 chemical method, physical method, virus mediated method 등 3가지로 분류할 수 있다. Chemical method 에는 calcium-phosphate, DEAE-dextran, Lipofectin등의 cationic liposome 등이 DNA를 packaging하는 agent 로 사용된다. Physical method로는 electroporation, gene gun 등이 이용되며, 그밖에 virus-mediated method로서 adenovirus나 retrovirus의 virus genome에 원하는 DNA를 cloning 삽입하여 세포에 감염시키는 방법도 많이 사용되고 있다. 각각의 방법은 저마다의 장점과 단점이 있으므로 실험목적과 잘 맞는 방법을 선택하여야 할 것이다.

실험방법

* 실험재료
10cm dish에 배양한 NIH3T3 cell
DMEM(10% FCS, antibiotics 함유)
Phosphate Buffered Saline
1x Trypsin-EDTA
Serum free medium(serum과 antibiotics가 첨가되지 않은 DMEM) 또는 opti-MEM
6 well plate
0.4% tryphan blue solution
hemocytometer
cover glass
cell counter
Lipofectamin plus^TM(BRL)
DNA
Transfection에 사용할 DNA는 CsCl 법이나 이에 상응하는 방법으로 분리한 ultra pure한 상태이어야 한다. Qiagen의 midi column을 사용하면 간편하게 0.1 mg 이상의 pure DNA를 얻을 수 있다.

1) Cell Plating

Transfection 하기 하루 전에 cell을 6 well plate에 plating 한다. Transfection을 위해서는 cell의 density가 culture vessel의 50 내지 70% 정도가 되어야 하므로 cell을 detach 한 후 hemocytometer를 이용하여 cell 갯수를 counting한 후 35 mm 지름 well(6 well plate)의 경우 약 2 x 10⁵ 개 정도의 cell을 plating 한다. 이 갯수는 cell line 에 따라 다소 다르므로 예비실험으로 다양한 농도로 cell을 plating 한 뒤 다음날 현미경으로 cell density를 관찰하고 적당한 갯수를 정하여 본 실험에 사용하는 것이 바람직하다.

1. 10 cm dish 의 cell을 PBS로 2회 washing 한다.

2. Trypsin-EDTA 처리 후 FCS가 함유된 DMEM을 10 ml넣고 50 ml cornical tube로 옮긴 후 pipette으로 suspension 하여 single cell로 잘 부유 시킨다.

3. 이중 20 μl를 eppendorf tube로 옮기고 tryphan blue 20 μl를 섞는다.

4. Hemocytometer에 cover glass를 덮고 3의 mix에서 10 μl를 취하여 hemocytometer의 V-모양의 홈(그림 참조)에 loading하면 모세관 현상에 의하여 고르게 loading된다.

5. 현미경 하에서 cell counter를 이용하여 cell의 개수를 측정한다. Hemocytometer를 현미경 하에서 관찰하면 아래의 그림과 같은 grid를 볼 수 있다. 오른쪽 그림과 같이 크게 아홉 개의 square가 있으며 각각의 square는 가로 세로가 1 mm인 정사각형이다. 실험자에 따라서 간편하게 가운데 square에 분포하는 cell 만을 측정하기도 하나 흔히 A,B,C,D 네 곳에서 cell 갯수를 세고 평균을 구한다. Tryphan blue 염색에 의하여 죽은 세포는 짙은 푸른색으로 염색이 되나 살아있는 세포는 염색이 되지 않으므로 살아있는 세포수만을 측정한다.

6. 하나의 square의 부피는 0.1 mm³ (1 mm×1 mm×0.1 mm), 즉 10^-4 ml 이므로 2의 세포 현탁액의 농도는 세포수x10⁴/ml 가 된다. 예를 들어 A,B,C,D 에 분포하는 cell 개수가 160개 이면 한 square의 cell 수는 40개이며 여기에 tryphan blue에 의한 희석배수 2를 곱하여 80×10⁴/ml, 즉 8×10⁵/ml 가 된다.

7. 6 well plate에 필요한 cell 수를 계산하고 2의 세포 현탁액에서 필요한 부피를 취하여 다른 cornical tube에 넣는다. 6 well plate의 한 well 에는 2 ml 의 medium을 사용하므로 필요량의 medium을 더 첨가하여 섞은 후 well 마다 2 ml씩 분주한다.

8. CO₂ incubator에서 넣은 후 다음 날 transfection에 사용한다.

2) Transfection

여기에서는 chemical method의 한 가지인 cationic liposome을 이용한 방법을 설명하고자 한다. BRL사 에서 Lipofectamin plus 라는 상품명으로 판매하는 transfection reagent는 적은 양의 DNA로도 높은 transfection efficiency를 얻을 수 있는 장점이 있으나 매우 고가의 시약이다. 본 설명의 DNA 양 및 시약 사용량은 직경 35 mm well (6 well plate) 에 실험할 경우이므로 다른 scale 의 plate를 사용할 경우에는 해당하는 scale에 맞게 조정해야 한다.

1. PBS, serum 및 antibiotics 가 첨가되지 않은 medium을 30분 전에 37°C water bath에 담가놓는다.

2. Clean bench 내에서 멸균된 eppendorf tube에 DNA를 혼합한다. (6 well 기준, 1 well 당 1 μg 정도)

3. Serum free medium 또는 Opti-MEM 100 μl 와 Plus reagent 4 μl를 혼합하여 이를 DNA와 잘 혼합한다(pipette 사용). 15분간 상온에서 incubation 한다.

4. Serum free medium 또는 Opti MEM 100 μl에 Lipofectamin을 2 μl 가하고 이를 3과 혼합한 다음 15분간 상온에서 incubation 한다.

5. Incubation 하는 동안, 6 well plate를 PBS (1 ml/well) 2번 세척한다.

6. Serum free medium을 well 당 0.8 ml 씩 가한다.

7. 4의 DNA mix를 6의 well 에 넣고 plate를 가볍게 흔들어 골고루 섞이게 한다.

8. CO₂ incubator에서 3시간 incubation한 후 serum 및 antibiotic이 포함 되어있는 complete medium으로 갈아주고 다시 CO₂ incubator에서 배양한다.

G. Conditional Expression

Plasmid DNA를 유핵세포에 transfection하는 이유는 특정 유전자를 cell 내에서 발현시키고자 함이다. 따라서 expression vector는 대개 발현하고자 하는 유전자를 CMV promoter나 SV40 promoter 등, 강력한 viral promoter에 의해 발현이 유도되도록 고안한다. 그러나 실험 목적에 따라서는 적절한 시기에 적절한 cell type 에서만 유전자를 발현시키고 또 원하는 시기에 발현을 정지시켜야 하는 경우가 있을 수 있다. 이러한 목적을 위해서는 사용하는 promoter를 임의대로 turn-on하고 turn-off하는 system이 필요하다. Bacterial expression에서 흔히 사용하는 IPTG induction을 생각해 보자. Lactose가 없을 때에는 lac operon에 연결되어있는 target gene의 발현이 억제되어있지만 IPTG가 첨가되면 비로서 활발히 발현된다. 이같이 외부로부터 signal을 주면 target gene이 발현되고 이를 제거하면 발현이 억제되는 조절 system을 eukaryotic cell culture에서도 가능케 하는 여러 가지 방법들이 개발되어오고 있으며, 통상 conditional expression system이라고 부른다. 여러 실험자들이 다양한 방법의 conditional expression system을 개발하여 보고하고 있으나, 아직까지 상품화된 것은 Clontech(USA)사의 Tet-on^TM & Tet-off^TM Gene Expression Systems 정도이다. 본 장에서는 이제껏 개발되어온 몇 가지 system에 대하여 간략히 원리만을 소개하기로 한다.

Conditional expression system의 예

1. IPTG based regulatory system

Target gene 발현 vector의 TATA box 앞에 lac operator sequence를 삽입하고, mutated lac repressor를 발현하는 vector와 co-transfection 한다. Mutated lac repressor는 herpes simplex virus protein 인 VP16의 activation domain이 fusion 되어 IPTG 존재 시에만 transcription activator로서 기능 한다.

2. Tetracyclin based regulatory system

E. Coli의 tetracycline resistance operator(tetO)를 minimal promoter 앞에 삽입한 target gene 발현 vector가, tetracycline-controlled transactivator(tTA)에 의해 발현되도록 하는 system이다. Tet-off system 에서, tTA는 tetracycline이 존재 할 때는 tetracycline 과 결합하여 transcription repressor로 작용하나 tetracycline을 제거하면 target gene의 발현을 유도하는 activator로 기능한다. 그러나 이 방법을 사용할 경우에는 culture medium에 항상 tetracyclin을 첨가하여 배양해야 하기 때문에 cell 성장에 좋지 않은 영향을 줄 수 있다. 때문에 이와는 반대로 tetracyclin 존재 시에만 activator로서 작용하는 reverse tTA(rtTA)를 사용하는 Tet-on system 도 개발 되었다. 원하는 시기에만 target gene을 발현 시킬 수 있는 장점 외에도 tetracycline 첨가량에 따라 유전자 발현량도 정밀하게 조절해 줄 수 있는 특징이 있다.

3. CID (chemical inducers of tenderization) based regulatory system

Eukaryotic cellular protein인 FKBP와 FRAP는 rapamycin에 의해서 hetero-dimerization 하는 특징이 있다. FKBP에는 특정한 DNA sequence를 인식하는 DNA binding domain을 fusion하고 FRAP에는 NF-kB의 transactivation domain인 p65를 fusion하여 이들을 함께 발현시키고, rapamycin을 공급해 줄 경우에만 이들이 transcription factor로 활동하게 하여 target gene의 발현을 유도하는 system이다. 그러나 rapamycin은 cell 내의 수많은 신호전달 과정에 관여하므로 원치 않는 side effect가 생길 수 있는 단점이 있다.

4. Ecdysone based regulatory system

Insect steroid hormone인 ecdysone을 inducer로 사용하는 system이다. Ecdysone receptor(EcR)를 VP16과 fusion 시키고 EcR의 dimerization partner인 USP를 함께 expression한다. Target gene의 upstream에는 USP가 binding 할 수 있는 sequence를 삽입한다. Ecdyson을 공급해 주어야만 EcR과 USP가 dimerization하여 transcription activator로 활동한다. 그러나 USP는 mammalian RXR의 homologue이므로 side effect를 완전히 배제할 수 없는 단점이 있다.

5. Estrogen based regulatory system

Yeast transcription factor인 GAL4의 DNA binding domain(DBD)에 nuclear hormone receptor인 estrogen receptor의 ligand binding domain(LBD)와 VP16의 transcription activation domain을 fusion 시킨 artificial transcription factor와 GAL4 responsive element를 minimal promoter 앞에 삽입시킨 target gene expression vector를 함께 transfection한다. 이 artificial transcription factor는 ligand인 estrogen이 존재하지 않을 때에는 inactive한 상태를 유지하나 estrogen을 공급하면 active한 transcription factor로 활동하여 target gene을 발현시킨다. 그러나 endogenous estrogen에 의한 target gene의 발현이나 exogenous estrogen에 의한 부작용 등이 이 system의 단점이다.

6. RU486 based regulatory system

위의 estrogen based regulatory system과 유사하게, 또 다른 nuclear hormone receptor인 progesterone receptor의 mutant를 이용한 system이다. Gal4 DBD와 VP16 사이에 progesterone receptor의 LBD를 삽입시키되 progesterone에는 반응하지 않고 이의 antagonist인 mifepristone(RU486)에만 반응하는 mutant LBD를 삽입한 artificial transcription factor를 사용한다. Estrogen based regulatory system과 매우 유사하나 몇가지 개선된 점들이 있다. 즉, endogenous progesterone에 의한 발현(leaky expression)을 배제할 수 있으며 antiprogestone effect를 나타내지 않는 극미량의 mifepristone으로도 target gene 발현을 유도할 수 있다.