Plate는 박테리아가 자랄 수 있는 최적의 환경이어야 한다. 박테리아는 plate 상에서 자라 colony를 형성하는데, 한 개의 colony는 한개의 clone으로부터 자란 것이므로 이를 분획하여 여러 실험에 사용할 수 있게 된다. Plate의 조성은 배양시 사용하는 액체 배지(media)의 조성에 agar를 첨가한 것이다. 이때 첨가하는 agar의 농도는 1.5%이며, top agar와 같은 특수한 용도로 사용하기 위해서는 agar의 농도를 변화시키기도 한다.

실험방법

1. Plate를 만들고자 하는 배지를 만든다. 각 배지의 조성은 다음과 같다.

1) LB 배지 (Luria-Bertani medium) 1 liter

bacto-tryptone 10 g
bacto-yeast extract 5 g
NaCl 10 g

* 실험실에서 가장 흔히 사용되는 배지이다. 위 성분 950 ml의 증류수에 녹인 후 pH를 7로 맞추기 위해 5 N NaOH를 첨가(약 200 μl)하고 증류수로 1 liter로 채운다음 autoclave한다.

2) TB 배지 (Terrific Broth) 1 liter

bacto-tryptone 12 g
bacto-yeast extract 24 g
glycerol 4 ml

* Glycerol이 첨가되어 균을 단시간에 대단히 높은 농도로 배양할 수 있는 배지이다. 900 ml의 증류수에 녹인 후 autoclave한다. 사용하기 직전에 phosphate buffer(0.17 M KH₂PO₄, 0.72 M K₂HPO₄)를 100 ml 첨가한 후 사용한다. Phosphate buffer는 90 ml 증류수에 2.31 g의 KH₂PO₄와 12.54 g의 K₂HPO₄을 잘 녹인 후 증류수로 100 ml 까지 채우고 멸균하여 사용한다.

3) SOB 배지1 liter

bacto-tryptone 20 g
bacto-yeast extract 5 g
NaCl 0.5 g

* Competent cell 제조시에 사용하는 배지이다. 950 ml의 증류수에 녹인 후 250 mM KCl 10 ml를 첨가하고 5 N NaOH를 이용하여 pH를 7로 맞춘 다음 증류수로 1 liter까지 채우고 autoclave한다. 사용하기 직전에 멸균한 2 M MgCl₂를 최종농도 20 mM이 되도록 첨가하여 사용한다.

4) SOC 배지 (Terrific Broth)

* 20 mM의 MgCl₂가 함유된 SOB 배지에 20 mM glucose가 첨가된 배지이다. 1 M glucose 용액은 100 ml에 18 g의 glucose를 녹여 0.22 μm-pore의 filter를 통과시켜 사용한다. 박테리아의 형질전환시에 사용한다.

5) M9 Minimal 배지 1 liter

Na₂HPO₄-7H₂O 6 g
KH₂PO₄ 3 g
NaCl 0.5 g
NH₄Cl 1 g

* M13 phage의 cloning 시에 사용할 수 있다. M9 plate를 제조하는경우는 agar 첨가 후 멸균한 배지가 적당히 식었을 때 다음과 같은 것들을 넣어준 다음 plate를 만들어야 한다.

20% glucose (filtered) 10 ml
0.1 M CaCl₂ (autoclaved) 1 ml
1 M MgSO₄ (autoclaved) 1 ml
100 mg/ml Thiamine (filtered) 50 ml

6) Brain infusion 배지 (Penassay 배지) 1 liter

0.15% beef extract
0.15% yeast extract
0.5% peptone
0.1% glucose
0.35% NaCl
0.37% K₂HPO₄
0.13% KH₂PO₄

* 시약상에서 혼합된 가루를 판매하므로 1 liter를 제조하기 위해 37 g을 혼합하여 사용한다.

2. 위의 배지는 액체로 사용하기도 하는데, 이를 이용한 plate를 만드는 경우 autoclave를 하기 전에최종농도 1.5%가 되도록 agar powder(15 g/liter)를 첨가한다.

3. 15 lb/sq로 20분 이상 autoclave한다.

4. 배지가 적당히(65°C 정도) 식을 때까지 기다린 후 필요하면 ampicillin을 60 μg/ml가 되도록 첨가하고 잘 흔들어 섞는다.

* Ampicillin은 가루를 증류수에 녹여 50~100 mg/ml의 농도로 만들고 filter 후 1 ml 씩 분주하여 -20°C에 보관한다.

5. 배지를 petridish에 조심스럽게 붓고 기포가 생기면 달구어진 loop를 이용하여 제거한다. 하루정도 상온에 놓아둔 후 wrap으로 잘 싸서 4°C에 뒤집어서 보관한다.

* 배지의 온도가 너무 높으면 ampicillin의 활성이 떨어지고, 배지가 너무 식으면 plate를 제조하는 도중 배지가 굳을 가능성이 있으므로 적당한 온도에서 작업할 수 있도록 한다.

B. Competent cell의 제조

박테리아를 형질전환(transformation)시키는 대부분의 방법은 수많은 과학자들이 경험적으로 정리한 것이며 그 기전은 정확히 알려지지 않았다. 현재 실험실에서 competent cell을 제조하는 방법으로 다음과 같은 두가지가 주로 사용된다. 첫번째 방법은 fresh frozen 방법으로 DH1, DH5, MM294등의 E. coli를 높은 효율(5 ×10⁸ transformed colonies/μg of supercoiled DNA)로 형질전환시킬 수 있으며, strain에 따라서 효율이 떨어지기도 하지만 사실상 거의 모든 경우에 사용할 수 있는 방법이다. 보다 간단한 방법인 두번째 방법은 calcium chloride를 이용하며 대략 10⁷ transformed colonies/μg of supercoiled DNA의 효율을 가지고 있다.

1) Fresh 또는 frozen 방법을 이용한 competent cell의 제조

이 방법은 Hanahan(1983)에 의해 개발된 방법으로 DH1, DH5, MM294등의 strain을 높은 효율로 형질전환할 수 있다. 다른 strain에서는 약 5∼10배 정도 효율이 떨어지고, MC1061 등은 이 방법으로 형질전환이 되지 않는다. 분주하여 -70°C deep freezer에서 2~3개월간 보관하여도 효율이 별로 감소하지 않는다.

실험방법

1. Agar plate(LB 또는 SOB)에 자란 E.coli DH5α colony를 SOB medium 3 ml(20 mM이 되도록 2 M MgCl₂를 30 μl 첨가)에 접종한 후 밤새 키운다. 효율을 증가시키기 위해서는 -70°C deep freezer에 보관한 frozen bacterial stock에서 새로 streak한 plate를 사용하는 것이 좋다.

2. 위에서 자란 균 2 ml를 200 ml의 SOB medium(20 mM이 되도록 2 M MgCl₂ 를 2 ml 첨가)에 다시 접종한 후 O.D.₆₀₀이 0.4가 될 때까지 shaking incubator에서 키운다. 보통 약 3∼4시간이 소요되며, 약 2시간 이후부터 30분마다 O.D.를 계속 측정해보는 것이 좋다(효율을 증가시키기 위해서 배양된 세균 수가 10⁸ cells/ml를 넘지 않는 것이 좋다). 이론상 E.coli는 최적 조건에서 doubling time이 20분이므로 이에 맞추어 시간을 추정해 볼 수 있으나 배양조건을 고려해야 한다.

3. 배양액을 멸균된 50 ml conical tube 4개에 나누어 넣고 얼음에 10분 방치한다.

4. 4,500 rpm, 4°C에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 tube를 뒤집은 상태로 약 1분간 놓아둔다.

5. 배양 부피의 1/3(tube당 15 ml) 되는 frozen storage buffer(FSB)에 세포침전물을 부유시킨다음, 두 tube씩 합쳐서 30 ml 씩으로 만든 후 얼음에 10분 놓아둔다. FSB의 성분은 표 1과 같다.

* 침전된 균을 부유시킬 때 vortex 보다는 pipetting으로 부유시키는 것이 좋은데, 이때 15 ml을 모두 넣고 부유시키려면 잘 되지 않는다. 처음 1~2 ml을 넣고 잘 부유시킨 다음에 15 ml 까지 FSB로 채우고, 잠깐동안 약하게 vortex를 하는 것이 좋은 방법이다.

6. 위와 같이 다시 원심분리한 후 처음 배양 부피의 1/12.5(tube 당 8 ml)되는 FSB에 부유시키고, 두 tube를 합쳐서 16 ml로 만든다.

7. DMSO를 3.5%(V/V)만큼 가한다(560 μl). 이때 DMSO는 세포 부유액의 중앙에 떨어뜨리고 곧바로 tube를 기울이면서 5∼10초간 부드럽게 섞도록 한다.

8. 얼음에 5∼15분 놓아둔다.

9. 다시 같은 양의 DMSO를 가하여 최종 농도가 7%(V/V)이 되도록 하고, 얼음에 10~15분 둔다.

10. 미리 차게해 둔 microfuge tube에 200 μl 씩 분주한다.

11. 사용할 때까지 -70°C deep freezer에 보관한다. 상온에 나와 한번 녹았던 competent cell은 다시 보관할 경우 효율이 대단히 감소하므로 버려야 한다.

표 1. FSB 제조 (1 liter)

* 위의 성분들을 모두 섞어 800 ml의 증류수에 녹인 다음, 0.1 N HCl을 이용하여 pH를 6.4로 맞춘다. 만약 pH가 6.4보다 낮아졌다면 염기를 가하여 다시 맞추지 말고 용액을 버린 다음 다시 처음부터 시작하여야 한다. 마지막으로 증류수로 최종 부피를 1 liter로 만든 다음 0.45-micron pore size filter로 여과하여 멸균된 용기에 담아 4°C에 보관한다.

2) Calcium chloride를 이용한 competent cell의 제조

이 방법은 Cohen등에 의해 개발된 방법을 약간 변형시킨 것으로, 효율은 Hanahan 방법에 비해 떨어지나 간편하고 보통 cloning목적으로 사용하기에는 충분하므로 실험실에서 많이 사용되는 방법이다. 이 방법으로 만든 competent cell은 시간이 오래 지날수록 형질전환 효율이 다소 감소하긴 하지만 -70°C deep freezer에 보관하여 사용할 수 있다.

실험방법

1. LB plate에 자란 DH5α colony를 LB 배지 2 ml에 접종한 후 밤새 키운다.

2. 위에서 키운 배양액 1 ml을 100 ml LB 배지가 담긴 플라스크에 넣고 O.D.₆₀₀이 0.4가 될 때까지 37°C shaking incubator에서 키운다.

3. 배양액을 50 ml conical tube에 넣고 얼음에 10분간 놓아둔다.

4. 4°C에서 4,500 rpm으로 10분간 원심분리한다.

5. 상층액을 완전히 제거한 후 미리 차게 해 둔 0.1 M filtered CaCl₂ 용액을 원래의 1/2부피로 넣고 부유시킨다.

6. 얼음에 15분 놓아두었다가 다시 4°C에서 3,000∼4,000 rpm으로 10분간 원심분리한다.

7. 상층액을 버리고 처음의 1/10 부피의 filtered CaCl₂ 용액으로 부유시킨다.

8. 얼음에 30분 놓아두었다가 미리 차게 해둔 microfuge tube에 200 μl 씩 분주하고, 사용할 때까지 deep freezer에 보관한다.

3) Ultra-competent cell의 제조(Inoue method)

최근에 Inoue에 의해 소개된 방법이다(Gene 96: 23-28, 1990). 낮은 온도에서 배양한 균을 쓰는 것이 특징으로, 대단히 높은 효율의 competent cell을 얻을 수 있다.

실험방법

1. Agar plate(LB 또는 SOB)에 자란 E.coli DH5α colony를 LB 또는 SOB medium(10 mM MgCl₂와 10 mM MgSO₄ 함유) 3 ml에 접종한 후 밤새 키운다.

2. 위에서 자란 균 1~2 ml을 250 ml의 SOB medium에 다시 접종한 후 18°C~상온에서 O.D.₆₀₀이 0.6이 될 때까지 shaking incubator에서 키운다.

* 18°C에서 배양하는 것이 힘들 때가 많기 때문에 상온에서 배양을 하게 되지만, 낮은 온도에서 배양하는 것이 높은 효율의 세포를 얻게 되는 주요 과정이다. 균 농도 보다는 배양 온도에 신경을 쓸 것. 전날 colony 한 개를 접종한 후 overnight으로 배양하면 아침에 대략 이 정도의 균 농도가 된다.

3. 배양액을 멸균된 50 ml conical tube에 나누어 넣고 얼음에 10분 방치한다.

4. 4,500 rpm, 4°C에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 tube를 뒤집은 상태로 약 1분간 놓아둔다.

5. 미리 차게 해 둔 80 ml의 transformation buffer(TB)로 부드럽게 부유시킨 후 얼음에 10분 놓아둔다. TB의 성분은 10 mM PIPES, 55 mM MnCl₂, 15 mM CaCl₂, 250 mM KCl이며, pH 6.7로 맞춘 용액이다.

6. 위와 같이 다시 원심분리한 후 20 ml의 TB에 부유시키고 DMSO를 7%(V/V)만큼 가한다. 이때 DMSO는 세포 부유액을 섞으면서 중앙에 천천히 떨어뜨린다. 다 넣은 후에도 5∼10초간 부드럽게 섞도록 한다.

7. 얼음에 10분 놓아둔다.

8. 미리 차게해 둔 microfuge tube에 200 μl 씩 분주한다.

9. 사용할 때까지 -70°C deep freezer에 보관한다.

C. 박테리아의 형질전환

박테리아의 형질전환이란 plasmid DNA를 세포 내로 넣어주는 작업을 말한다. 형질전환은 거의 모든 cloning과정에 필수적이므로 가능한 한 효율적인 방법을 찾는 것이 중요하다. Large DNA는 small DNA보다 형질전환 효율이 떨어지며 DNA의 양이 너무 많아도 좋지 않으므로, 같은 competent cell을 사용하더라도 적당한 길이와 적당한 양의 DNA를 사용하는 것이 중요한 요소이다.

실험방법

1. -70°C deep freezer에 200 μl 씩 보관된 competent cell tube 하나를 꺼내어 손바닥에 쥐고 있으면 cell 용액이 녹기 시작한다. Cell 용액이 다 녹으면 곧바로 얼음에 넣어둔다.

2. DNA를 competent cell에 넣고 tube를 4~5번 기울이거나 가볍게 손끝으로 쳐서 부드럽게 섞는다.

* DNA 용액은 competent cell 부피의 5%를 넘지 않는 것이 좋다. 대개 competent cell은 200 μl를 사용하므로 DNA는 10 μl 이하로 조정한다. DNA의 양이 많다고 효율이 점점 증가하지는 않는다.

3. 얼음에 30분 동안 둔다.

4. 42°C 에서 90초간 heat shock을 준다.

5. 얼음에 2∼3분 두었다가 LB 또는 SOC 배지 (SOB 배지에 20 mM glucose 함유) 800 μl를 넣고 잘 섞은 후, 37°C 에서 45분간 배양한다. Rock table을 사용하여 흔들어 주는 것도 좋다.

6. 미리 37°C에 두었던 LB (with ampicillin) plate에 위 혼합액을 적당량 pipette으로 떨어뜨린 후, 밀대로 골고루 펴준다.

* LacZ 유전자를 이용한 color selection을 하는 경우, 배지에 isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG)와 X-gal을 첨가해주어야 한다. X-gal(50 mg/ml) 20~40 μl와 IPTG(839 mM) 5~10 μl를 미세원침관에서 섞어 배지위에 떨어뜨리고 밀대로 골고루 펴주면 되는데, 37°C에 적어도 10분 두었다가 박테리아를 도말하도록 한다. X-gal은 50 mg/ml의 농도로 dimethylformamide(DMF)에 녹여 빛이 차단된 용기에 담아 -20°C에 보관하고, IPTG는 2 g을 증류수에 녹여 10 ml 까지 채운다음 0.22 μm-filter하여 1 ml씩 나누어 -20°C에 보관한다.

* 위에서 만들어진 혼합액은 대략 1 ml 정도가 된다. 이 혼합액을 모두 plate에 떨어 뜨리고 밀면 잘 밀리지도 않고 물이 흘러 배양도 잘 되지 않는다. 그러므로 이 혼합액에서 적당량의 액체를 제거하는 방법으로 다음과 같은 방법을 쓴다.

1) 과정 5까지 끝낸 균 용액을 10,000 rpm에서 15초간 원심 분리한다.

2) 상층액을 약 850 μl 정도 버린다.

3) 나머지 150 μl로 침전물을 부유시키고, 이를 plate에 도말한다.

* 대부분의 경우 vector와 insert를 ligation한 DNA로 형질전환할 경우, 위와 같이 하면 colony들이 잘 분리되는 정도로 배양된다. 그러나 self ligation의 경우에는 colony가 너무 많이 생겨 colony들끼리 잘 분리되지 않는다. Double stranded circular DNA를 쓰는 경우에는 더욱 그러하므로, 위 과정을 경험적으로 조금씩 바꾸어 실험해야 할 것이다. 자신이 없는 경우는 균 혼합액을 10 μl, 100 μl, 나머지 용액 이렇게 나누어 도말해 보면 된다.

7. 37°C 배양기에서 plate를 뒤집어서 밤새 배양한다. 12∼16시간이면 colony를 관찰할 수 있다.