반면 mRNA는 세포내 전체 RNA중 1∼5% 정도를 차지하고 있으며 크기(수백개에서 수천개 염기)와 염기배열 순서가 다양하다. 그러나 거의 모든 포유동물의 mRNA에는 3'쪽 끝에 poly(A) tail이 있어 oligo(dT) cellulose를 이용한 affinity chromatography로 순수분리할 수 있다.

세포로부터 RNA를 원형대로 분리하기 위해서는 RNase의 작용을 최소화하는 것이 가장 중요하다. RNase는 여러형태의 물리적 작용에 저항성이 있지만 4 M guanidine isothiocyanate와 환원제인 β-mercaptoethanol 용액내에서는 불활성화된다. 또한 대부분의 단백질 역시 guanidine chloride나 guanidinium isothiocyanate와 같은 강력한 변성제 용액에 쉽게 녹는다. 단백질의 정렬된 2차 구조가 소실됨에 따라 세포구조가 붕괴되고 RNA나 DNA에 결합된 단백질 역시 핵산으로부터 분리된다. 따라서 이들 시약을 이용하여 RNA를 분리하면 RNase가 풍부한 췌장조직에서도 완전한 형태의 RNA를 분리할 수 있다.

본 장에서는 세포질과 핵을 쉽게 분리할 수 없는 세포(냉동 보관한 조직)나 RNase가 특히 많은 세포 (예: 췌장세포)에서 RNA를 분리하는 대표적인 두가지 실험방법과 oligo(dT) cellulose를 이용하여 전체 RNA로부터 poly(A)⁺ mRNA를 분리하는 실험을 소개한다.

* RNA 분리에 필요한 모든 시약은 DEPC를 처리한 증류수를 이용하여 제조하여야 한다. DEPC에 대해서는 RNA 분석 장을 참고하도록 한다.

A. Guanidinium/cesium chloride 방법

이 방법은 Glisin 등(1974)과 Ullrich 등(1977)이 기술한 방법을 변형한 것으로서 세포나 조직을 guanidinium thiocyanate로 파괴한 다음 균등액을 CsCl 용액 위에 얹어 원심분리하는 방법이다. CsCl 용액 (>1.8 g/ml)에서 RNA의 밀도는 다른 세포 구성성분보다 크므로 원심분리하는 동안에 DNA나 단백질은 용액내에 떠 있는 반면 RNA는 침전을 형성하게 된다.

실험방법

* 실험재료
Guanidinium thiocyanate 용액(4 M guanidinium thiocyanate, 1% β-mercaptoethanol, 0.1 M Tris-Cl, pH 7.5): Guanidinium thiocyanate 50 g과 pH 7.5인 1 M Tris-Cl 용액 10 ml를 각각 넣고 증류수로 100 ml가 되도록 하여 용해시킨다. 용액을 Whatman No.1 여과지로 여과하여 상온에 보관한다. β-mercaptoethanol은 사용직전에 농도가 1% 되도록 첨가하여 사용한다.
5.7 M CsCl, 0.01 M EDTA, pH 7.5: CsCl 96 g을 pH 7.5인 0.01 M EDTA 90 ml에 용해시킨 뒤 DEPC를 0.1% 되도록 첨가한다. 37°C에서 2시간 방치해 둔 다음 자가멸균한다. 용액이 식으면 DEPC를 처리한 증류수를 첨가하여 100 ml로 만든다.
TES 완충용액(10 mM Tris-Cl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.1% SDS)

1. 조직 절편이나 세포 침전물에 guanidinium thiocyanate 용액을 5배 부피만큼 가하고 Polytron homogenizer(Brinkmann)를 사용하여 1∼2분간 최고속도로 균등액을 만든다.

* 배양된 세포로부터 RNA를 분리하고자 하는 경우에는 지름 10 mm plate 한 개에서 떼어낸 세포당 4 M guanidinium thiocyanate 용액 6 ml와 β-mercaptoethanol 3.5 ml를 첨가하고 20G needle로 up and down하여 세포를 모두 깬 후 아래의 4번 과정으로 넘어간다.

2. 10% sodium lauryl sarcosinate 용액을 최종농도 0.5%가 되도록 가하고 용액을 잘 혼합한다.

3. 5,000 xg로 10분간 원심분리한 후 상층액을 새 시험관으로 옮겨 담는다.

4. 초원심분리기의 swing rotor에 맞는 시험관에 5.7 M CsCl, 0.01 M EDTA, pH 7.5 용액을 시험관 부피의 약 2/3 부피로 넣고 그 위에 균등액을 1/3 부피로 얹는다.

5. Rotor가 SW60인 경우 40,000 rpm에서 12시간, SW41인 경우 32,000 rpm에서 24시간, SW28인 경우 25,000 rpm에서 24시간 동안 20°C에서 초원심분리한다.

* 이 방법은 cesium chloride 용액에서 RNA의 밀도가 세포내 다른 어떤 거대물질의 밀도보다 크다는 것을 이용한 것이다. 원심분리하면 대부분의 DNA나 단백질은 cesium chloride 용액내에서 위로 뜨는 반면 RNA는 바닥에 침전물을 형성한다.

6. RNA 침전물이 시험관 바닥에서 떨어지지 않도록 상층액을 조심스럽게 버리고 70% ethanol로 시험관을 세척한다.

7. RNA 침전물을 처음의 균등액 10 ml 당 300 μl의 TES 용액에 용해시킨다.

8. 0.1배의 3 M sodium acetate, pH 5.2와 2.5배의 ethanol을 가하고 -20°C에 두시간 보관해 둔다.

9. 4°C에서 12,000 xg의 속도로 20분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨다.

10. 상층액을 제거한 후 침전물을 완전히 말린다.

11. 소량의 DEPC를 처리한 물에 RNA 침전을 용해시킨다.

12. 260 nm에서의 흡광도를 측정하여 농도를 결정한 다음 곧바로 실험에 이용하거나 미세원침관에 분주하고, 분주한 부피의 2.5배만큼 ethanol을 첨가하고 -70°C에 보관한다.

* 260 nm에서 흡광도가 1인 RNA용액의 농도는 40 μg/ml이고, 한가닥 DNA는 33 μg/ml, 쌍가닥 DNA는 50 μg/ml이다.

13. 보관된 RNA를 사용하고자 하는 경우에는 RNA 용액의 0.1부피만큼 3 M sodium acetate, pH 5.2를 가하고 4°C에서 12,000 xg의 속도로 15분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨 후 다시 녹여서 사용한다.

B. Guanidine HCl 방법

이 방법은 Strohman 등(1977)과 MacDonald 등(1987)이 기술한 방법을 변형한 것이다.

실험방법

* 실험재료
Guanidine HCl 용액 1(8 M guanidine HCl, 0.1 M Na acetate, pH 5.2, 1% β-mercaptoethanol): Guanidine HCl 191 g과 pH 5.2인 3 M sodium acetate 용액 8.35 ml를 넣고 증류수로 용해시켜 250 ml로 만든 후 Whatman No.1 여과지로 여과한 다음 갈색병에 넣어 상온에 보관한다. β-mercaptoethanol은 사용 직전에 최종농도 1%가 되도록 첨가하여 사용한다.
Guanidine HCl 용액 2 (8 M guanidine HCl, 0.1 M Na acetate, pH 7.0, 1% β-mercaptoethanol, 20 mM EDTA): Guanidine HCl 191 g과 pH 7.0인 3 M sodium acetate 8.35 ml, pH 8.0인 0.5 M EDTA 10 ml를 각각 넣은 후 증류수로 용해시켜 250 ml로 만들고 Whatman No.1 여과지로 여과한 다음 갈색병에 넣어 상온에 보관한다. β-mercaptoethanol은 사용 직전에 최종농도 1%가 되도록 첨가하여 사용한다.

1. 조직 1 g에 10 ml의 guanidine HCl 용액 1을 넣는다. 배양세포의 경우 confluent monolayer에 1 ml의 guanidine-HCl 용액 1을 넣고 배양기 바닥에 붙어 있는 세포를 policeman으로 긁어 떼어 내어 시험관에 옮긴다.

2. Polytron homogenizer(Brinkmann) 혹은 Contorque tissue grinder(Eberbach사 또는 Fisher사)를 이용하여 상온에서 1분간 균등액을 만든다.

3. 10% sodium lauryl sarcosinate용액을 최종농도 0.5%가 되도록 가하고 용액을 잘 혼합한다.

4. 5,000 xg로 10분간 원심분리한 후 상층액을 새 시험관으로 옮겨 담는다.

5. pH 5.2인 3 M sodium acetate 용액 0.1 부피를 첨가하고 잘 혼합한 후 차게 한 ethanol을 0.5 부피만큼 첨가하고 잘 섞는다.

6. -20°C에 2시간동안 보관해 둔다.

7. 4°C에서 12,000 xg의 속도로 20분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨다.

8. 상층액을 제거한 후 침전물을 완전히 말린다.

9. 침전물을 원래 균등액의 0.5 부피의 guanidine HCl 용액 2에 용해시킨다.

10. 차게 한 ethanol을 0.5 부피만큼 첨가하고 잘 섞은 후 -20°C에 2시간동안 보관해둔다.

11. 4°C에서 12,000 xg의 속도로 20분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨다.

12. 상층액을 제거한 후 침전물을 완전히 말린다.

13. 침전물에 pH 8.0인 20 mM EDTA 용액 5 ml를 넣고 약 2분간 진탕하여 침전물을 녹인다. 이때 용해되지 않는 침전물은 원심분리하여 제거한다.

14. 동일한 부피의 chloroform/n-butanol(4:1 v/v)을 첨가하고 2분간 진탕하여 잘 섞는다.

15. 5,000 xg로 10분간 원심분리한 후 상층액을 새 시험관으로 옮겨 담는다.

16. pH 7.0인 4 M sodium acetate 용액을 3 부피만큼 첨가하고 -20°C에 2시간동안 보관해 둔다.

17. 4°C에서 12,000 xg의 속도로 20분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨다.

* 이 과정에서 DNA는 상층액에 남고 RNA만 침전된다.

18. 상층액을 제거한 후 침전물을 완전히 말린다.

19. 소량의 DEPC를 처리한 물에 RNA 침전을 용해시킨다.

20. 0.1배의 3 M sodium acetate, pH 5.2와 2.5배의 ethanol을 가하고 -20°C에 두시간 보관해둔다.

21. 4°C에서 12,000 xg의 속도로 20분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨다.

22. 상층액을 제거한 후 침전물을 완전히 말린다.

23. 소량의 DEPC를 처리한 물에 RNA 침전을 용해시킨다.

24. 260 nm에서의 흡광도를 측정하여 농도를 결정한 다음 곧바로 실험에 이용하거나 미세원침관에 분주하고, 분주한 부피의 2.5배만큼 ethanol을 첨가하고 -70°C에 보관한다.

25. 보관된 RNA를 사용하고자 하는 경우에는 RNA 용액의 0.1부피만큼 3 M sodium acetate, pH 5.2를 가하고 4°C에서 12,000 xg의 속도로 15분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨 후 다시 녹여서 사용한다.

C. Guanidinium thiocyanate 방법

RNase가 대량 포함된 조직이나 세포로부터 RNA를 분리하고자 하는 경우 첫번째 과정에서 guanidinium thiocyanate가 포함된 용액을 사용함으로써 양질의 RNA를 분리할 수가 있다. 본 장에서 기술하는 RNA 분리 방법은 백서의 췌장으로부터 RNA를 분리하는 방법을 기준으로 한 것이다.

실험방법

* 실험재료
Guanidinium thiocyanate 용액(4 M guanidinium thiocyanate, 1% β-mercaptoethanol, 0.1 M Tris-Cl, pH 7.5)
Guanidine-HCl 용액 2(8 M guanidine-HCl, 0.1 M Na acetate, pH 7.0, 1% β-mercaptoethanol, 20 mM EDTA)

1. 조직 1 g에 10 ml의 guanidinium-thiocyanate 용액을 넣는다. 배양세포의 경우 monolayer에 1 ml의 guanidinium-thiocyanate 용액을 넣고 배양기 바닥에 붙어 있는 세포를 policeman으로 긁어 떼어 내어 시험관에 옮긴다.

2. Polytron homogenizer(Brinkmann) 혹은 Contorque tissue grinder(Eberbach사 또는 Fisher사)를 이용하여 상온에서 1분간 균등액을 만든다.

3. 10% sodium lauryl sarcosinate 용액을 최종농도 0.5%가 되도록 가하고 용액을 잘 혼합한다.

4. 5,000 xg로 10분간 원심분리한 후 상층액을 새 시험관으로 옮겨 담는다.

5. pH 5.5인 2 M potassium acetate 용액 0.5 ml와 1 M acetic acid 0.8ml을 첨가하고 잘 혼합한 후 차게 한 ethanol 7.5 ml을 잘 섞으면서 서서히 첨가한다.

6. -20°C에 2시간동안 보관해 둔다.

7. 4°C에서 12,000 xg의 속도로 20분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨다.

8. 상층액을 제거한 후 침전물을 완전히 말린다.

9. 침전물을 5 ml의 guanidine-HCl 용액 2에 용해시킨다.

10. 차게 한 ethanol을 0.5부피만큼 첨가하고 잘 섞은 후 -20°C에 2시간동안 보관해둔다.

11. 4°C에서 12,000 xg의 속도로 20분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨다.

12. 상층액을 제거한 후 침전물을 완전히 말린다.

13. 침전물에 pH 8.0인 20 mM EDTA 용액 5 ml를 넣고 약 2분간 진탕하여 침전물을 녹인다.

* 이때 용해되지 않는 침전물은 원심분리하여 제거한다.

14. 동일한 부피의 chloroform/n-butanol(4:1 v/v)을 첨가하고 2분간 진탕하여 잘 섞는다.

15. 5,000 xg로 10분간 원심분리한 후 상층액을 새 시험관으로 옮겨 담는다.

16. pH 7.0인 4 M sodium acetate 용액을 3 부피만큼 첨가하고 -20°C에 2시간동안 보관해둔다.

17. 4°C에서 12,000 xg의 속도로 20분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨다.

* 이 과정에서 DNA는 상층액에 남고 RNA만 침전된다.

18. 상층액을 제거한 후 침전물을 완전히 말린다.

19. 소량의 DEPC를 처리한 물에 RNA 침전을 용해시킨다.

20. 0.1배의 3 M sodium acetate, pH 5.2와 2.5배의 ethanol을 가하고 -20°C에 두시간 보관해둔다.

21. 4°C에서 12,000 xg의 속도로 20분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨다.

22. 상층액을 제거한 후 침전물을 완전히 말린다.

23. 소량의 DEPC를 처리한 물에 RNA 침전을 용해시킨다.

24. 260 nm에서의 흡광도를 측정하여 농도를 결정한 다음 곧바로 실험에 이용하거나 미세원침관에 분주하고, 분주한 부피의 2.5배만큼 ethanol을 첨가하고 -70°C에 보관한다.

25. 보관된 RNA를 사용하고자 하는 경우에는 RNA 용액의 0.1부피만큼 3 M sodium acetate, pH 5.2를 가하고 4°C에서 12,000 xg의 속도로 15분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨 후 다시 녹여서 사용한다.

D. Poly(A)⁺ RNA 분리

전체 RNA로부터 polyadenylated RNA를 분리하기 위한 여러 방법이 개발되어 왔다. 최선의 방법은 oligo(dT)-cellulose를 개발한 chromatography이며 이는 Gilham(1964)의 방법에 의해 준비를 하거나 상품화된 것을 사용하면 된다. Oligo(dT)-cellulose ml 당 10 mg정도의 RNA까지 분리가 가능하다.

실험방법

* 실험재료
Oligo(dT) 결합용액(10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% SDS)
Oligo(dT) 세척용액(10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA)
Oligo(dT) 용출용액(10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA)
0.1 M NaOH, 5 mM EDTA 용액

1. 멸균된 용출용액에 oligo(dT)-cellulose 1 g을 부유시킨다.

2. 1∼5 ml 용적의 일회용 column이나 pasteur pipette에 oligo(dT)-cellulose를 packing한 후 column 부피의 5배에 해당하는 다음의 용액으로 column을 씻어낸다.

1) DEPC로 처리한 증류수
2) 0.1 M NaOH, 5 mM EDTA
3) DEPC로 처리한 증류수

3. 5배 column 부피의 멸균된 결합용액으로 column을 씻어낸 다음 pH 종이를 이용하여 용출되어 나오는 용액의 pH가 7.5임을 확인한다.

4. 멸균된 증류수로 RNA를 녹이고 65°C에서 5분간 가열한다.

5. 같은 부피만큼 2x 결합용액을 가하고 실온까지 식힌 후 column 상단에 조심스럽게 넣은 다음 유출액을 모아 다시 65°C에서 5분간 가열하고 식힌 후 column을 통과시킨다.

6. 5 column 부피의 멸균된 결합용액으로 column을 씻고, 다시 5 column 부피의 세척용액으로 column을 세척한다.

7. 260 nm에서 용출액의 흡광도를 측정하면 처음에는 nonadenylated RNA가 빠져 나오므로 흡광도가 매우 높지만 세척이 끝날 때 쯤이면 흡광도가 0에 가까와진다.

8. 2∼3 부피의 멸균된 용출용액으로 poly(A)⁺ RNA를 용출시킨 후 용출되어 나오는 용액을 시험관에 1/3∼1/2 column 부피씩 모은다.

9. 각 시험관에 모은 용액의 흡광도를 260 nm에서 측정하여 RNA 용출 분획을 모은다.

* Oligo(dT)-cellulose chromatography로 위에서와 같이 한번 분리한 RNA에는 polyadenylated RNA와 non-polyadenylated RNA가 거의 반반씩 존재한다. 따라서 poly(A)⁺ RNA를 더 정제하기 위해서는 용출된 RNA 용액의 sodium chloride 용액 농도를 0.5 M로 맞추고 위의 과정 4, 5, 6을 반복한다.

10. 분리한 RNA 용액에 최종농도가 pH 5.2인 3 M sodium acetate 용액을 0.1 부피 가하고 2.5배의 ethanol을 첨가한다.

11. -20°C에 2시간동안 보관해 둔 다음 4°C에서 12,000 xg의 속도로 20분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨다.

12. 상층액을 제거한 후 침전물을 완전히 말린다.

13. 소량의 DEPC를 처리한 물에 RNA 침전을 용해시킨다.

14. 260 nm에서의 흡광도를 측정하여 농도를 결정한 다음 곧바로 실험에 이용하거나 미세원침관에 분주하고, 분주한 부피의 2.5배만큼 ethanol을 첨가하고 -70°C에 보관한다.

15. 보관된 RNA를 사용하고자 하는 경우에는 RNA 용액의 0.1부피만큼 3 M sodium acetate, pH 5.2를 가하고 4°C에서 12,000 xg의 속도로 15분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨 후 다시 녹여서 사용한다.

* 위의 방법으로 10⁷ 세포로부터 1∼5 μg의 poly(A)⁺ RNA를 분리할 수 있다. Oligo(dT)-cellulose는 위의 과정 2, 3에서 제시한 대로 sodium hydroxide, 물, 결합용액 순서로 씻은 후 재사용할 수 있다.

* RNA 시료 수가 많으면 oligo(dT)-cellulose를 이용하여 batch chromatography를 하는 것이 효과적이다.

* Batch chromatography

RNA를 결합용액에 녹인 후 RNA 0.5 mg 당 0.3 g의 oligo(dT)-cellulose를 가하고 상온에서 15분간 혼합한다. 15°C에서 1,500 xg의 속도로 4분간 원심분리하고 상층액을 제거한 뒤 실온에서 5 ml의 결합용액으로 oligo(dT)-cellulose를 원심분리방법으로 5회 세척한다. 멸균된 용출용액 1 ml로 4회에 걸쳐 poly(A)⁺ RNA를 oligo(dT)-cellulose로부터 떼어낸 후 위의 과정 10부터 실험을 진행한다.