Sanger의 방법은 dideoxy chain termination 방법, 효소를 이용한 방법 등으로 불리우며, DNA polymerase I(혹은 T7 DNA polymerase, Taq DNA polymerase)과 동위원소로 표지된 nucleotide ([α-³⁵S]dATP, [α-³²P]dATP)와 나머지 세종류의 표식이 안된 nucleotide가 들어있는 반응액을 4가지 2',3'-dideoxyribonucleotide가 각각 한 종류씩 들어있는 tube에 옮겨 반응시킨다. 이때, dideoxy analog에는 3'-OH가 없기 때문에 더이상 새로운 DNA 합성이 일어나지 못하므로 여러 크기의 DNA fragment 를 얻게 되고, 이를 denaturing polyacrylamide gel에 전기영동하면 DNA의 염기배열 순서를 결정할 수 있다. Template DNA로는 double strand plsmid, M13 single strand DNA, double strand or single strand PCR product를 이용할 수 있다.

최근에는 실험과정을 간편하게 진행할 수 있도록 여러 회사에서 반응용 kit를 상품화하여 판매하고 있고, 전기영동 기구들도 여러가지가 고안되어 있으므로 아무 것이나 편리한 것을 선택하여 사용한다. 본 실험과정에서는 Pharmacia사에서 판매하는 T7 sequencing kit를 이용한 방법을 위주로 설명하고자 한다.

DNA sequencing의 원리

Double strand plasmid DNA를 이용하여 DNA sequencing을 시행하는 경우 기본적으로 다음과 같은 과정으로 나눌 수 있다.

1) Denaturation of template DNA

Double strand DNA를 쓰는 경우 pH를 높여 주거나 열을 가하여 DNA를 변성시키고, 이 상태로 침전하는 과정을 말한다. Single strand DNA의 경우에는 이 과정이 필요없거나 간단하여 실험 결과가 훨씬 더 좋아지므로 DNA 분리나 cloning과정의 불편을 감수하고 이를 쓰는 실험자도 많다.
 

2) Annealing of the primer

Sanger 방법은 DNA를 합성하는 것이 기본인데, DNA polymerase의 기본 작용 조건은 template와 primer가 있어야 한다는 것이다. 따라서 template DNA 내에 일부 염기서열을 알고 있어야지만 primer를 합성하여 쓸 수 있는데, plasmid를 사용하는 경우 vector의 multiple cloning site 부근에 해당하는 primer를 쓸 수 있으므로 대단히 편리하다. 이 과정에서는 적당한 온도와 반응 조건에서 template와 primer가 결합하게 된다.

 

3) Labeling reaction

이 과정에서는 나중에 형성된 산물들이 모두 방사성 동위원소로 표지되어 X-ray 필름에 노출시 감광되어 눈으로 확인할 수 있게 하는 과정이다. 가능한 한 생성되는 모든 DNA 산물에 동위원소를 표지하기 위해서 DNA polymerase에 의한 DNA chain 합성과정에서 우선적으로 동위원소가 표지된 nucleotide가 들어갈 수 있도록 조건을 정해주고 있다.

4) Extension/termination reaction

모든 chain에 동위원소가 표지된 후 적당 비율의 deoxynucleotide(dNTP)와 dideoxynucleotide (ddNTP)에 노출시켜 각 반응중에 DNA chain이 합성되기도 하고(extension), ddNTP가 들어가면 중지되기도 하게(termination) 조건을 정해주었다. 한 tube에서 한종류의 ddNTP(예, ddCTP)를 넣어준다면 그 tube에는 모두 ddCTP로 끝난 DNA 산물을 가지게 되므로 이를 전기영동하여 template 상에 G(상보적인 strand는 C)가 어느 부위에 있는지를 파악할 수 있게 된다.
 

5) Stop reaction과 전기영동

모든 반응을 정지시키고, 이를 denaturing polyacrylamide gel에서 전기영동한다. 이 전기영동은 단지 한개의 nucleotide 차이에 의한 이동속도의 구별이 될 수 있도록 민감하게 디자인되어있다.
 

A. DNA 염기서열 결정 반응

실험방법

1. Template DNA(plasmid DNA) 18 μl에 2 N NaOH/2 mM EDTA 2 μl를 넣고 vortex한 후 간단히 centrifuge하고 10분간 실온에 방치한다.

* Template DNA의 양은 1.5 μg/kb의 양으로 준비하며, 정량하지 않은 DNA인 경우 2 ml 배양액에서 분리한 plasmid DNA를 모두 쓰면 된다.

2. 2 M ammonium acetate, pH 4.6 2 μl와 순수한 ethanol 75 μl을 넣어 섞은 후 -70°C에 10분간 둔다. -20°C에 20분 두어도 좋다.

3. 4°C에서 15,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 200 μl의 70% ethanol을 넣고 다시 4°C(또는 상온)에서 5~10분간 원심분리한 다음 상층액을 완전히 제거한다.

4. 변성된 DNA 침전물에 다음과 같은 성분을 넣어 Annealing mix를 준비한다.

증류수 10 μl
Primer(2.5 pmole/μl) 2 μl
Annealing buffer 2 μl

모두 넣은 다음 vortex하여 잘 녹인 후 간단히 원심분리하고 37°C에 20분 방치해 두었다가 다시 실온에 10분간 두어 annealing이 일어나도록 한다.

* Primer는 한 template 반응당 5~7.5 pmole 정도면 충분하다. Sequencing에 사용하는 primer는 합성한 후 PAGE 정제를 거쳐서 사용해야 깨끗한 반응을 기대할 수 있다.

5. 다음 반응에 들어가기 전에 dideoxynucleotide가 첨가되어 있는 Sequencing mix(A mix, C mix, G mix, T mix)를 4개의 tube에 각각 2.5 μl씩 담아 37°C incubator에 넣어두어 나중에 반응시킬 때 온도가 맞추어져 있도록 한다.

* Sequencing mix는 dNTP와 ddNTP 농도 비율에 따라서 short type과 long type이 있다. Short type은 500 bp 이내의 염기서열을 결정하는데 용이하게 되어있어 primer에서 가까운 염기서열부터 읽을 수 있으므로 보통의 경우에는 short type을 사용한다.

6. 다음과 같이 kit에 들어있는 재료들을 이용하여 Enzyme mix를 준비한다.

증류수 1 μl
Label mix-dATP 3 μl
Diluted T7 DNA polymerase(1.5 units/μl) 2 μl
[α-³⁵S]dATP(600 Ci/mmole, 10 mCi/ml) 1 μl

* 위 혼합액은 template 한개에 쓸 수 있는 것이며, 7 μl가 된다. 이중 7번 과정에서 6 μl를 쓰게 되는 것이므로 모자를 것을 걱정하지 않아도 된다. 만약 template가 n개이면 위의 각 성분에 n을 곱하여 만들면 될 것이다.

* 동위원소가 표지된 dNTP를 [α-³⁵S]dCTP로 하고자 할 때에는 Label mix-dCTP를 쓴다. 또한 이후의 모든 과정에서 사용되는 동위원소 폐기물은 모두 따로 분류하여 적당한 절차를 거쳐서 수거해야 한다.

* Kit에 공급되어 있는 효소는 8 units/μl로 되어있다. 한 template 반응당 필요한 효소량이 3 units임을 생각하여 해당량을 쓰고 나머지를 enzyme dilution buffer로 채우면 된다.

7. 위 14 μl의 Annealing mix에 6 μl의 Enzyme mix를 pipetting으로 혼합하고 실온에 5분간 방치하여 labeling한다.

8. 과정 7의 반응액 중에서 4.5 μl 씩을 미리 37°C에 넣어둔 2.5 μl의 Sequencing mix에 섞고, 37°C에서 5분간 extension/termination 반응을 진행한다.

9. 모든 원침관에 5 μl의 stop solution을 첨가하여 반응을 끝낸다.

* Stop solution에는 반응중지역할을 하는 EDTA와, DNA 변성에 역할을 하는 formamide, 그리고 염료가 들어있다.

10. 반응물은 80°C 이상의 온도에서 2~3분 가열하고 곧바로 얼음속에 넣은 후 전기영동을 실시할 때까지 -20°C에 보관한다.

B. Denaturing PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)

Dideoxy 방법을 이용한 DNA의 염기서열결정은 denaturing polyacrylamide gel을 이용하여 시행한다. 이 gel 용액내에 함유되어 있는 고농도(7 M)의 urea와 높은 전압으로 인해 발생되는 열이 DNA 변성에 중요한 역할을 한다. Gel의 크기는 한번 전기영동시 분석할 수 있는 염기 수를 극대화하기 위해 40 cm 이상의 길이로 하며, 각 염기 band의 해상도를 높이기 위해 매우 얇은 두께(0.35 mm)를 사용한다. Polyacrylamide의 농도는 분석하려는 DNA의 크기에 따라 다양하게 조절할 수 있으며, 15∼120개 범위의 염기서열을 결정하는데는 보통 8% polyacrylamide gel을 사용한다. Stop solution에 포함되어 있는 tracking dye는 bromophenol blue와 xylene cyanol을 사용하며 이들 dye의 이동위치를 통해 전기영동 정도를 짐작할 수 있다.

실험방법

* 실험재료
40% acrylamide 용액 (38% acrylamide, 2% N,N'-methylene bisacrylacrylamide)
20x TBE 완충용액(Tris base 121 g, boric acid 61.7 g, EDTA 7.44 g per 1 liter H₂O)

1. 전기영동을 위한 acrylamide gel의 제조를 위해 표 1을 참고로 하여 필요로 하는 재료들을 혼합한다. 여기서는 8% acrylamide denaturing gel을 제조하기 위해 100 ml의 용액을 만드는 경우를 예로 들어 설명한다.

표 1. Denaturing acrylamide gel 용액의 제조와 전기영동시 염료의 위치

2. 40% acrylamide stock solution 20 ml, 20x TBE 5 ml, 증류수 40 ml와 urea 42 g을 혼합하고 잘 녹인다. 너무 따뜻한 물에서 녹이면 gel을 만들 때 금방 굳어버리기도 하므로 주의한다.

3. 3MM 여과지로 한번 여과하여 squeezing bottle에 담아둔다.

4. 전기영동 기구를 준비하고 gel을 만들 유리판을 setting한다.

* 전기영동용 유리판은 물로 깨끗이 닦은 후 alcohol로 다시 닦은 다음 alcohol이 완전히 마른 후 한쪽면을 siliconization시킨 후 사용한다. Siliconization은 chloroform에 dichlorodimethyl silane이 0.5% 혼합된 용액을 사용하여 장갑을 끼고 paper towel에 용액을 묻힌 후 유리판 위가 매끈하게 느껴질 때까지 유리판을 문지른다.

5. Gel 용액에 TEMED 75 μl와 30% ammonium persulfate 260 μl를 첨가하여 섞고 바로 준비된 유리판에 붇는다.

* TEMED와 ammonium persulfate 용액을 많이 혼합하거나 gel 용액의 온도가 높으면 gel이 빨리 굳게 되고, 용액을 적게 혼합하거나 gel 용액의 온도가 낮으면 gel이 느리게 굳으므로 조절을 잘 해야 한다.

6. Gel이 완전히 굳으면 전기영동 기구에 유리판을 끼우고 1,800 Volt로 약 30분간 prerun을 한 후 shark tooth comb을 장치한다. Comb size에 따라 sample을 1∼3 μl apply하고 적당한 시간 동안 전기영동을 시작한다.

7. 표 1을 참고로 하여 전기영동의 진행정도를 파악하고, 전기영동이 끝나면 유리판을 전기영동 기구에서 분리한 후 spacer와 comb을 제거하고 쐐기모양의 separator를 이용하여 한쪽 유리판을 gel에서 떼어낸다.

8. Gel이 붙은 유리판을 5% methanol, 5% acetic acid 용액에 20분간 담가두어 gel로부터 urea를 제거하고 고정시킨다.

* Urea가 남아있으면 말린 후에 gel이 끈적끈적하여 X-ray 필름에 달라붙게 된다. Sequencing 반응시에 동위원소로 [³⁵S]를 사용한 경우는 동위원소 활성이 낮아서 자가방사법 시행시 랩으로 gel을 싸지 않으므로 gel이 film에 붙지 않도록 하기위해 이 과정이 반드시 필요하지만 [³²P]를 사용한 경우는 동위원소 활성이 높아서 랩으로 gel을 싸더라도 충분히 감광이 되므로 urea를 제거하는 과정을 실시할 필요가 없다.

9. 용기로부터 용액을 제거하고 gel 크기보다 조금 더 큰 Whatman 3MM 여과지에 gel을 붙인다음 진공 건조기를 이용하여 gel을 완전히 말린다.

10. Gel이 완전히 마른 후 자가방사법을 시행한다. [³⁵S]를 사용한 경우에는 실온에서 시행을 하고, [³²P]를 사용한 경우에는 -70°C에서 자가방사를 시행한다. 하룻밤동안 방치해 둔 후 현상하여 염기서열을 분석한다.

* 참고사항
1. 염기서열을 읽을 때는 band의 존재유무와 간격을 함께 고려해야 한다. 반드시 있어야 할 위치에 아무 것도 보이지 않거나 없어야 할 위치에 band가 보이면 원인을 조사하고 분명한 결과를 얻도록 해야 한다.
2. 염기서열에 확신을 가지려면 반응을 양방향으로 실시하여 양쪽(sense와 antisense strand)의 염기서열을 따로 읽은 후 대조하는 방법이 좋다. 한 방향으로만 읽은 염기서열은 오류가 생길 가능성이 크기 때문이다. 한 필름의 염기서열도 두차례 읽은 다음 확인을 하는 것이 좋다. 3. 반응이 끝난 후에는 곧바로 전기영동을 하는 것이 좋지만 -20°C에 1주일 정도는 보관해 두었다가 사용해도 결과를 판독하는 데에는 장애가 없다.