1944년 O. Avery에 의해 DNA가 유전물질임이 밝혀진 후 유전학, 분자생물학 등의 과목은 눈부시게 발전하여 현재는 DNA 조작기술이 그 나라 과학 발전의 척도를 가늠할 정도에까지 이르고 있다.

본 장에서는 조직, 혈액, 배양된 세포로부터 염색체 DNA를 분리하는 방법과 plasmid DNA를 분리하는 방법을 나누어 설명하고자 한다.

A. 포유동물세포로부터 염색체 DNA의 분리

질병과 연관된 여러가지 연구에서는 환자의 조직이나 세포를 이용하여 염색체 DNA와 mRNA를 분리하는 것이 기본적인 방법이 된다. 따라서 많은 수의 표본을 보다 간편하고 빠르게, 또한 적은 양의 재료만 있어도 우수한 효율로 분리할 수 있는 기술이 필요하게 된다. 몇년 전까지만 해도 염색체 DNA 분리과정은 적어도 하루 이상의 시간을 필요로 하였을 뿐만 아니라, 많은 양의 세포가 있어야 가능한 방법을 써 왔기 때문에 연구에 어려움이 많았다. 그러나 많은 과학자들과 시약 회사의 노력으로 인하여 현재는 약 1시간 정도면 적은 양의 세포에서도 매우 순수한 DNA를 추출해낼 수가 있게 되었다. 상품으로 나와 있는 여러 kit들은 소유권 문제로 시약 성분을 정확히 공개하고 있지 않아 그 원리를 이해하기 어려운 점은 있으나, 이제는 점점 kit를 쓰는 것이 일반화되었으므로 여기에서 다루기로 하겠다. 하지만 원리를 이해하기 위해서는 옛 방법을 이해해야 하며, 많은 양의 DNA를 분리하고자 할 때에는 여전히 옛 방법을 쓰는 것이 좋다.

1) 포유동물세포로부터 염색체 DNA의 분리 (conventinal method)

실험방법

* 실험재료
Phosphate-buffered saline[PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM sodium phosphate(dibasic), 1.4 mM potassium phosphate(monobasic)]: NaCl 8 g, KCl 0.27 g, Na₂HPO₄(dibasic) 1.15 g, KH₂PO₄(monobasic) 0.2 g을 녹이고 증류수로 1 liter를 맞춘다.
추출용액 (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.1 M EDTA, 20 μg/ml pancreatic RNase A, 0.5% SDS)
Acid citrate dextrose solution B: Citric acid 0.48 g, sodium citrate 1.32 g, glucose 1.47 g을 증류수에 용해시켜 100 ml로 희석한다.
Proteinase K (Proteinase K powder를 10 mM Tris-Cl, pH 7.4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.4% SDS에 녹인다. 그러나 증류수에 녹여 사용하여도 무방하다)

1. DNA를 분리하고자 하는 재료에 따라 다음과 같은 과정을 실시한다.

1) 세포배양기에서 단층으로 자란 세포

차게 한 PBS(phosphate-buffered saline) 용액으로 단층의 세포들을 두차례 세척한다. 세포의 종류에 따라 policeman으로 긁거나 trypsin, trypsin-EDTA로 처리하여 1∼10 ml의 차게 한 PBS 용액으로 부유시킨 후 500 xg에서 5분간 원심분리한다. 상층액을 제거하고 적당량의 PBS를 가하여 침전된 세포를 다시 세척한다. pH 8.0인 TE 완충용액으로 세포를 부유시킨 뒤(5×10⁷ 세포당 1 ml 사용) 새 conical tube에 옮기고 세포부유액 1 ml당 10 ml의 추출용액을 첨가하고 37°C에 1시간 이상 보관해 둔다.

2) 세포 배양액내에서 자란 세포 (배양기 바닥에 붙지 않고 떠서 자라는 세포)

배양액을 conical tube에 옮긴 후 4°C에서 900 xg로 5분간 원심분리하여 세포를 침전시킨다. 이후의 과정은 위와 같다.

3) 혈액

Acid citrate dextrose solution B 3.5 ml가 들어 있는 시험관에 20 ml의 신선한 혈액을 받는다. 이 혈액은 0°C에서 수일간 보관하거나 혹은 -70°C에서 수개월 보관한 후 DNA를 분리하여도 무방하다. 신선한 혈액인 경우에는 1,300 xg로 15분간 원심분리하여 상층의 혈장을 제거하고 pasteur pipette을 사용하여 buffy coat를 새 시험관으로 옮긴다. Buffy coat를 20 ml의 PBS 용액으로 부유시킨 후 같은 방법으로 원심분리한 다음 반복하여 buffy coat를 분리한다. 추출용액 15 ml에 buffy coat를 부유시키고 37°C에 1시간 이상 보관해 둔다.

얼린 혈액일 경우에는 수욕에서 녹인 후 동량의 PBS 용액을 첨가하여 혼합한 다음 3,500 xg로 원심분리하여 상층액을 제거한다. 이때 적혈구는 용혈되어 상층에 존재하게 된다. 침전물을 15 ml의 추출용액에 부유시키고 37°C에 1시간 이상 보관해 둔다.

4) 조직

Waring blender의 스테인리스 컵에 액체질소를 넣고 여기에 조직을 갈아서 넣는다. 최고속도로 조직을 갈아서 분말이 되도록 한 다음 액체질소를 증발시킨다. 적당한 크기의 삼각플라스크에 조직 부피의 10부피로 추출용액을 넣고 여기에 조직 분말을 조금씩 첨가하면서 혼합하여 조직 분말이 용액내에 고르게 부유되도록 한 다음 37°C에 1시간 이상 보관해 둔다.

2. Proteinase K 용액을 최종농도가 조직과 세포는 1 mg/ml, 혈액의 경우에는 100 mg/ml이 되도록 첨가하고 유리막대를 이용하여 조심스럽게 섞는다.

3. 용해된 세포 용액을 50°C 수욕에서 간헐적으로 섞어 주면서 3시간 동안 반응시킨다.

4. 용액을 상온에서 식힌 뒤 tube로 옮기고 동량의 phenol/chloroform/isoamylalcohol(25:24:1)을 첨가하고 뚜껑을 막은 뒤 조심스럽게 천천히 상온에서 10분간 수용액층과 유기용매층을 섞는다.

5. 상온에서 5,000 xg로 15분간 원심분리하여 수용액층과 유기용매층을 분리한다.

* Phenol은 pH 8.0인 Tris-Cl 용액으로 평형시킨 후 사용하여야 한다. 그것은 phenol의 pH가 8.0이면 유기용매층과 수용액층 사이에 DNA가 걸려 채취하기 곤란한 경우를 방지해 주기때문이다.

6. 수용액층을 새 원심분리관으로 옮긴다.

* DNA의 농도가 높으면 점도가 매우 크므로 조심해서 다루어야 한다. 즉 수용액층을 옮길 때 DNA 용액을 천천히 빨아올려서 중간층의 물질이 따라 올라가지 않도록 하여야 한다. 중간층의 물질이 따라 올라가면 phenol:chloroform 추출을 다시 한번 시행해야 한다. 또 상층액을 뜨는 것이 용이하지 않으면 긴 파이펫을 이용하여 하층액을 제거하는 것도 좋다.

7. 단백질이 완전히 제거되었다고 생각할 때까지 phenol:chloroform 추출을 반복한다.

* 단백질이 제거되었는지의 여부는 흰색을 띠고 중간층에 모여진 물질이 있는지 없는지를 보아서 결정한다.

8. 약 200 kb 이상의 DNA를 분리하고자 할 경우에는 추출한 DNA 용액을 4°C의 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA 용액에서 투석을 실시한다. 투석된 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA 용액의 흡광도가 270 nm에서 0.05 이하가 될 때까지 계속한 후 pH 8.0인 TE 용액에서 4시간 이상 투석한다.

9. 약간의 기계적 손상을 감수할 경우에는 DNA 용액에 10 M ammonium acetate 용액을 최종농도 2.5 M이 되도록 첨가하고 4°C에 보관되어 있는 2.5배 용량의 ethanol을 넣으면 즉시 DNA가 침전된다.

* 10 M ammonium acetate 대신 pH 5.5인 3 M sodium acetate 0.1 부피를 첨가하여도 된다.

10. 실타래처럼 엉기는 물질이 바로 염색체 DNA이다. 이것을 건져 내어 ethanol이 날아갈 때까지 실온에 두어 말리거나 진공펌프를 연결하여 건조시킨다.

11. DNA를 건져낸 후 남은 용액은 12,000 rpm으로 4°C에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 완전히 제거하고 나면 DNA를 더 얻을 수 있다.

12. TE 완충용액을 적당량(5 ml) 첨가한 후 DNA가 충분히 녹을 때까지 4°C에 보관하였다가 분광광도기로 정량한 다음 실험에 이용한다.

* 분광광도기로 260 nm와 280 nm에서 DNA 용액의 흡광도를 측정하였을 때 A₂₆₀/A₂₈₀의 값이 1.75 이상이 되어야 한다. 이보다 낮으면 단백질이 포함되어 있음을 의미하므로 phenol:chloroform 추출을 다시 시행하여야 한다.

* 260 nm에서 흡광도가 1일 때 double strand DNA는 50 μg/ml, single strand DNA는 33 μg/ml, RNA는 40 μg/ml을 의미한다.

2) QIAamp kit를 이용한 염색체 DNA의 분리

이 방법은 혈액이나 조직에서 단 20분만에 DNA를 분리할 수 있다. 효율은 200 μl의 whole blood에서 6 μg DNA, 200 μl의 buffy coat, 10⁷ lymphocyte나 cultured cell에서 50 μg DNA를 분리할 수 있다. 조직을 쓸 땐 25 mg 조직에서 40 μg을 얻을 수 있다고 한다. 한 column 당 100 μg의 DNA까지 결합할 수 있고, 보통은 25 mg sample(200 μl)에 맞게 설계되어 있으나 최소 1 μl, 최대 1 ml(50 mg)까지 쓸 수 있다.

실험방법

1A. (혈액, 혈장, 혈청, buffy coat, body fluid, 임파구, 배양세포인 경우) 200 μl의 재료를 미세원침관에 옮긴다. 임파구나 배양세포는 10⁷ 세포를 200 μl의 PBS에 풀어 옮긴다. 배양세포가 단층세포일 때는 배양접시에 붙어있는 상태에서 PBS 1 ml로 두번 세척하고 PBS를 200 μl를 첨가한 후 policeman으로 긁어 옮긴다.

* Sample이 200 μl 이하면 PBS로 부피를 맞춘다.

* QIAamp spin column은 RNA와 DNA를 동시에 분리한다. RNA는 PCR 반응에는 별영향을 못 주지만, 다른 효소반응을 억제시킬 수 있다. 굳이 RNA를 제거하고 싶다면 RNase A(20 mg/ml)을 위 과정에서 20 μl 첨가하고 2분간 상온에 둔 다음 과정 2를 진행한다.

* 마지막 7 과정에서 필요한 추출용액(증류수, TE, 또는 AE 용액)을 미리 70°C에 넣어둔다.

1B. (조직인 경우) 25 mg의 조직(비장은 10 mg)을 잘게 잘라 미세원침관에 넣고 ATL 용액을 180 μl 첨가한다.

2A. (혈액, 혈장, 혈청, buffy coat, body fluid, 임파구, 배양세포인 경우) Kit에서 제공되는 QIAGEN protease(2 mg/ml) 25 μl과 AL 용액 200 μl를 넣고 즉시 15초간 vortex하여 잘 섞는다.

* 이 과정은 세포를 파괴하는 과정이므로 즉시 균등히 섞는 것이 중요하다. 위 두 시약을 직접 섞지 말고 하나씩 첨가해야 한다.

2B. (조직인 경우) Proteinase K(not QIAGEN protease) 20 μl를 첨가하여 섞고 55°C에서 흔들면서 조직이 완전히 용해될 때까지 둔다. 대개 1~3시간 소요되며 밤새 두는 것도 좋다. 이후, RNaseA(20 mg/ml) 20 μl를 첨가하여 상온에 2분 두었다가 AL 용액을 200 μl 넣고 잘 섞는다.

3. 70°C에서 10분간 둔다.

4. Isopropanol이나 순수한 ethanol을 210 μl 첨가한다.

* 혈액, 혈장, 혈청인 경우는 isopropanol을, 나머지와 조직은 ethanol을 쓴다.

5. Column을 collection tube에 설치하고 위 혼합액을 apply한 다음 뚜껑을 닫고 8,000 rpm에서 1분간 원심분리한다.

* Buffy coat나 임파구는 최고속도를 쓰는 것이 좋다.

6. 빠져나온 용액을 버리고, 다시 설치한 다음 AW용액을 500 μl 가하고 다시 원심분리한다. 이 과정을 한번 더 반복하고 빠져나온 용액을 버린 다음, 그 상태로 다시 2분간 최고속도로 원심분리하여 남은 용액을 모두 제거한다.

* 위 과정을 거듭하여도 column의 가장자리 턱에 걸린 소량의 용액이 빠지지 않는다. 이를 흡입기를 이용하여 제거해야한다.

7. Column을 새 미세원침관(1.5 ml-microfuge tube)에 옮기고 미리 70°C에 넣어두었던 증류수나 TE, pH 8.0, 또는 AE 용액 200 μl 첨가하고 1분간 두었다가 8,000 rpm에서 1분간 원심분리한다.

* 용액을 첨가한 후 5분간 column 자체를 70°C에 두면 더 효율이 증가한다고 한다. 또한 위 추출과정을 한번 더 반복하면 15% 정도의 효율 증가를 기대할 수 있다.

B. Plasmid DNA의 분리

Plasmid DNA란 염색체 밖에 존재하는 DNA(extrachromosomal small circular DNA)이다. Plasmid DNA는 그 자체내에 replication origin을 가지고 있어서 박테리아 내에서 염색체 DNA 복제와 상관없이 독자적으로 복제되는 특징이 있다. 박테리아의 항생제에 대한 내성이 한 세포에서 다른 세포로 옮겨질 때 plasmid를 통해 이루어진다고 알려진 후 항생제 내성에 대한 유전자 뿐 아니라 항생제 합성이나 독물질 합성, 질소고정 및 분해, 여러 효소들에 대한 유전자를 함께 가지고 있음이 밝혀졌다.

Plasmid는 한 세포에서 다른 세포로 옮겨갈 수 있는 성질을 지니고 있으므로 유전자를 옮기는 운반자 혹은 vector로 작용을 한다. 항생제 내성을 지닌다는 이유로 의사들에게는 반갑지 않은 존재로 여겨지지만 분자생물학의 연구에 있어서는 유전자 특성 규명에 없어서는 안될 중요한 수단으로 이용되고 있다. 즉 외부에서 연구하고자 하는 DNA 조각을 plasmid에 삽입하여 연결시킨 후 박테리아에 넣어 주면 이 형질전환된 세포내에서 DNA는 독자적으로 복제되므로 DNA 조각을 cloning하는 vector로 이용될 수 있는 것이다.

분자생물학 실험에 사용되는 plasmid는 자연계에 존재하는 plasmid의 특정 부위를 조합하여 만든 plasmid가 이용된다. 이러한 plasmid는 작고 활성이 높은 relaxed replication origin을 가지고 있으며 적어도 항생제 내성에 대한 한개의 유전자를 지니고 있다. 또한 이들 plasmid 내에는 한가지 제한효소에 의해 단지 한군데만 절단될 수 있는 부위를 여러개 가지고 있으므로 실험실 내에서의 조작을 쉽게 해주고 있다.

Plasmid의 소량분리도 최근 여러가지 kit가 상품화되어 있으며 많은 sample을 동시에 빠르고 간편하게 분리할 수 있는 장점은 있지만 경제적이지 못하기 때문에 여기에서는 보통 쓰는 alkali lysis 방법을 기술하기로 하겠다.

실험방법

* 실험재료
용액 1 (solution 1): 50 mM glucose, 25 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA
100 ml 정도 만들어서 자가멸균한 후 4℃에 보관하여 사용한다.
용액 2 (solution 2): 0.2 N NaOH, 1% SDS
실험 때마다 새로 만들어서 사용하는 것이 좋다.
용액 3 (solution 3): 5 M potassium acetate 60 ml, glacial acetic acid 11.5 ml, 증류수 28.5 ml을 첨가하여 만든다.

1. Ampicillin이 60 μl/ml로 첨가된 LB 또는 TB 배양액 3 ml에 박테리아의 colony를 접종하여 37°C 배양기에서 하룻밤동안 흔들면서 키운다.

* TB(terrific broth)를 쓰면 보다 짧은 시간 내에 더 많은 균을 얻을 수 있다. Colony의 접종은 loop를 이용하는 것이 원칙이나 이쑤시개를 이용하면 더 간편하게 빨리 할 수 있다.

2. 미세원침관에 빅테리아가 완전히 자란 배양액을 1.5 ml 담고 15,000 rpm으로 1분간 원심분리하여 박테리아를 침전시킨다.

3. 상층의 배양액을 완전히 제거하고 남은 균용액을 다시 넣어서 침전시킨다.

4. 박테리아 침전물에 용액 1을 200 μl 넣고 진탕하여 부유시킨다.

* 완전히 부유시키지 못하면 효율이 대단히 줄어든다. 원침관의 바닥에 남아있는 균이 없도록 철저히 진탕할 것.

* 용액 1, 2, 3의 양은 균의 양에 따라서 달라질 수 있다. 즉 균이 많으면 300-300-300 μl를 쓰면 된다. 다만 용액들의 비율을 1:1:1로 쓰면 되는데, 때로는 이 비율을 1:2:1.5로 쓰기도 한다. 그러나 앞의 것이 더 깨끗한 DNA를 얻을 수 있는 것 같다. 실험자에 따라서 용액 1에 RNase A를 200 μg/ml 농도로 첨가해서 사용하기도 하지만, 이보다는 과정 10에서 RNase 처리를 해주는 것이 더 좋다.

5. 용액 2를 200 μl 첨가하고 뚜껑을 막은 후 시험관을 천천히 5회 정도 뒤집었다 세웠다를 반복하여 혼합한 뒤 5분간 상온에 둔다. 이때 절대로 진탕과 같이 거친 방법으로 혼합해서는 안된다.

* 용액 2를 첨가하면 세포가 용해되므로 sample이 맑아지고 점도가 높아지는 것을 관찰할 수 있다. 이 과정에서 심하게 vortex하면 염색체 DNA가 깨져 나중에 섞여서 분리되게 된다.

* 만약 5분이 지나도 용액이 혼탁하면 과정 4에서 진탕을 제대로 하지 않았거나 용액의 양이 모자란 경우이다. 용액을 300-300-300 μl 등과 같이 증가시킬 것.

6. 용액 3을 200 μl 첨가하고 손가락 끝으로 툭툭 쳐서 잘 섞은 후 얼음 속에 10분간 보관한다.

* 용액 3를 첨가한 직후 하얀 침전물이 형성되는데 이들이 눈송이 모양으로 균등하게 이루어져야 한다. 뭉쳐있어도 효율이 감소하고, 너무 심하게 섞어도 좋지 않다.

7. 4°C 미세원침기에서 15,000 rpm으로 10분간 원침시킨 후 상층액(550~600 μl)을 새 미세원침관으로 옮겨 담는다. 가능한 한 하얀 침전물이 섞이지 않도록 한다.

8. 옮겨 담은 상층액에 0.6~1배부피의 isopropanol을 첨가하여 혼합한 후 상온에 20분 정도 둔다.

9. 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하고 상층액을 완전히 제거한다.

10. RNase A가 50 μg/ml 함유된 TE, pH 8.0 용액 20~100 μl를 가하여 DNA 침전을 녹인다.

* 이 과정까지 진행한 후 제한효소 처리를 해도 대개 별 문제가 없지만, DNA를 보관하거나 다른 반응에 쓰려는 경우는 다음 과정을 거쳐 DNA를 순수분리해야 할 것이다.

11. 37°C에서 20~30분간 방치한다.

12. 동량의 1.6 M NaCl/13%(w/v) PEG 8,000(polyethylene glycol)을 첨가하고 4°C에 10분 두었다가 4°C 미세원침기에서 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하고, 상층액을 완전히 제거한 다음 TE, pH 8.0 용액 100 μl에 침전물을 녹인다.

* 이 과정은 짧은 길이로 절단된 RNA 분자들을 제거하는 과정이며, 침전물이 눈에 보이지 않게 되므로 초보자가 실험하기에 어려운 점이 있다. 대개의 경우 생략해도 별 문제가 없다.

13. 동량의 phenol/chloroform/isoamylalcohol(25:24:1)용액을 넣고 진탕한 다음 2분간 원심분리하고, 상층액을 새 미세원침관으로 옮긴다. 이 과정을 2~3번 반복하여 단백질을 제거하도록 한다.

* Phenol이 유독 물질이므로 조심하도록 한다. Phenol은 TE, pH 8.0으로 saturation시켜 사용하며, 빛이 차단된 용기에 보관해야 한다. 산화를 방지하기 위하여 8-hydrochinoline을 0.05%(w/v) 첨가해서 쓰기도 하는데 이 때 phenol 층이 엷은 노란 색을 띠게 되므로 수용액 층과 구분이 되어 편리하다.

14. 0.1 부피의 3 M sodium acetate, pH 5.2와 2.5 부피의 순수한 ethanol을 첨가하고 -20°C에 20분 이상 두어 DNA를 침전시킨다.

15. 4°C 미세원침기에서 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하고, 상층액을 완전히 제거한 다음 70% ethanol을 200~500 μl 넣고 다시 원심분리하여 세척한다.

16. 상층액을 완전히 제거하고 뚜껑을 연채로 5분 정도 말린다음 원하는 양의 TE, pH 8.0 용액 또는 증류수에 녹인다.