유전자 재조합 과정에 사용되는 ligase는 주로 DNA ligase이며 이 효소는 원핵세포, 진핵세포, 바이러스 등에서 유래한 것이 있는데, 현재 많이 사용되는 ligase는 T4 DNA ligase와 E. coli DNA ligase이다. T4 DNA ligase는 cofactor로 ATP를 필요로 하고, E. coli ligase는 NAD⁺를 필요로 한다. 이들 두 ligase는 blunt-ended DNA, cohesive-ended DNA, nicked DNA등에 모두 작용할 수 있으나 E. coli DNA ligase 는 T4 DNA ligase와 비교할 때 blunt-ended DNA에 작용하는 힘이 약하므로 일반적인 유전자 재조합 과정에서는 T4 DNA ligase를 더 많이 사용하는 경향이 있다.

A. Cohesive end ligation

실험방법

1. 실험에 사용할 vector와 insert를 준비한다. 물론 vector와 insert는 끝이 같은 모양을 하고 있어야 한다. 즉 같은 제한효소에 의해 절단되어 같은 조각을 이루고 있어야 한다.

2. Vector와 insert의 몰비(molar ratio)가 1:2를 이루도록 미세원침관에 혼합하여 담는다.

* 일반적으로 vector의 크기 1 kb당 50~100 ng의 양이면 vector의 양은 충분하며 insert는 크기에 따라 vector와 몰비를 고려하여 혼합한다. 몰비는 실험자에 따라서 1:1(equimolar)에서 1:4까지도 쓰며 특수한 경우에는 insert를 더 많이 넣기도 한다.

* Ligation된 DNA는 형질전환에 그대로 이용하는 경우가 대부분이다. 그런데 한번의 형질전환에 이용되는 DNA의 부피는 대개 10 μl이므로(2장 박테리아의 형질전환 참고) ligation의 최종부피가 너무 많으면 좋지 않다. 대개는 10~30 μl 정도로 한다.

3. 10x ligation buffer(전체부피의 1/10)와 T4 DNA ligase(1 μl)를 혼합하고 잘 섞는다.

* 10x ligation 완충용액의 조성은 시약회사마다 조금씩 다르긴 하지만 대개의 경우 500 mM Tris-Cl, pH 7.8, 100 mM MgCl₂, 200 mM DTT(dithiothreitol), 10 mM ATP이다.

* 제조회사에서 나오는 T4 DNA ligase는 unit 수가 다르게 표시되어 있는 경우가 많다. Cohesive end ligation unit 1 unit는 0.015 Weiss unit에 해당한다. 예를들어 Poskochem enzyme은 100 cohesive end ligation unit/μl이고 Amersham enzyme은 2.5 Weiss unit/μl로 되어 있는데, 대개는 모두 반응 당 1 μl를 쓴다. 또한 enzyme에 딸려오는 buffer에는 대개 ATP가 들어있으므로 반드시 설명서를 잘 읽고 써야 한다. One-phor-all buffer를 쓸 수도 있는데, 이때는 ATP를 따로 넣어주어야 한다.

* ATP는 cohesive end ligation인 경우 최종 1 mM, blunt end인 경우 최종 0.5 mM로 하는 것이 최적 반응조건이지만 대개는 모두 1 mM로 쓴다.

4. 적당한 온도(보통 16°C 또는 22°C)에서 4시간 이상 반응시킨다.

5. Ligation 반응이 끝나면 4°C에 보관하였다가 박테리아의 형질전환 또는 다른 목적에 이용한다.

* 형질전환 시에는 competent cell이 200 μl로 분주되어 있으므로 위의 ligation 혼합액 중 8~10 μl만써서 형질전환 하고 나머지는 보관한다.

B. Blunt end ligation

실험방법

근본적으로 cohesive end ligation과 같은 원리이지만 blunt end인 경우 cohesive end인 경우보다 효율이 낮으므로(1/10에서 1/100 정도) T4 DNA ligase의 양을 더 많이 사용하거나 vector, insert의 양을 더 많이 사용하는 것이 좋다. ATP의 농도는 0.5 mM일 때가 최적으로 알려져 있으며 ATP의 농도가 높으면 반응이 억제될 수 있지만. 대부분의 회사에서 나오는 10x ligation buffer에 ATP가 10 mM로 들어있기 때문에 cohesive end와 마찬가지로 최종 1 mM로 쓸 때가 많다. One-phor-all buffer를 써서 다음과 같이 조성을 정하는 것도 좋다. 효소는 1 μl만 넣어도 blunt end ligation에 충분한 양이고, 너무 많은 양을 넣으면 glycerol 때문에 오히려 활성이 떨어질 우려가 있다.

DNA mix (insert and vector) 20 μl
10x One-phor-all buffer 3 μl
10 mM ATP 1.5 μl
sterile water 4.5 μl
T4 DNA ligase 1.0 μl
(전체부피 30 μl)