이 문서는 2002년 1월 연세대학교 의과대학 심혈관유전체 연구소에서 열린 강연의 일부로 만들었던 자료입니다. 앞에서 설명한 부분과 중복되는 곳도 있지만 일부로 삽입하기보다는 따로 문서를 만드는게 나을 것 같아 여기에 정리합니다. 강의의 내용은 세 파트로서, 첫번째는 왜 RNA를 연구해야 하는가, 두번째는 RT-PCR이 무엇인가, 그리고 세번째에 실험에 대한 내용을 소개합니다.

왜 RNA를 연구하는가

앞에서 설명한 바와 같이 세포는 외부의 자극에 따라서 분화하거나 반응을 하게 되어있습니다. 우리가 실험할 때 항상 생각하는 것은 A와 B가 무엇이 다를까, 다르다면 왜 다를까, 이 다른 것을 이용해서 뭐 좀 새로운 치료나 획기적인 방법을 개발할 수는 없을까 하는 것입니다. 그러므로 무엇이 다른가 하는 것이 아주 중요할 수 밖에 없습니다

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그러면 뭐가 달라서 세포의 반응이 달라질까요? 꾸준히 이 문서를 봐오셨으면 역시 "단백질" 이라는 대답을 하셔야겠지요. 그리고 단백질이 다르다는 것은 역시 유전자의 발현(gene expression)이 다르기 때문이라는 것을 이해하셨을 것으로 생각합니다. 그리고 central dogma에 의해서 mRNA가 다를 것이라고 생각할 수 있겠지요.

그래서 특정 mRNA의 양이나 구조를 분석하는 것이 유용하다는 것입니다.

윗 그림과 같이 차이가 있는 두가지의 그룹에서 RNA를 분리해서 그 차이를 비교하려는 것이지요. 그런데 total RNA를 분리해서 전기영동해보면 위 사진과 같이 차이가 없습니다. 왜 그럴까요? 그것은 아래 그림과 같이 우리가 관심있는 mRNA는 total RNA의 극히 일부에 지나지 않기 때문입니다.

전체 RNA의 1% 정도만이 mRNA인데다가 우리가 관심있는 특정 mRNA는 그 중에서도 극히 일부입니다. 따라서 total RNA로부터 어떻게 하면 특정 mRNA의 차이를 알아낼 수 있을까 하는 것이 중요한 문제입니다. 이 목적으로 쓰는 실험은 크게 3가지로 나눌 수 있겠습니다.

1. Northern blot hybridization
2. RNase protection assay (RPA)
3. RT-PCR

Northern은 가장 많이 써 온 고전적인 방법이며 정량적인 실험에서 아직도 최고로 우수한 방법입니다. 그 이후에 소개된 RPA는 probe 디자인 및 제작이 까다롭지만 정량도 되면서 exon-intron 구조 파악이나 transcription initiation site의 규명 등에도 사용할 수가 있습니다. 하지만 정량을 목적으로 할 때는 아직 Northern blot이 더 많이 쓰이고 있습니다.

RT-PCR은 사실 RNA로부터 cDNA를 만들어 cloning하는 쪽으로 더 많이 쓰는 방법입니다. 정량도 가능하지만 (이럴 때는 semi-quantitative RT-PCR이라고 합니다) 사실 오차의 소지가 많아서 사람들이 잘 믿어주지 않을 때가 많습니다. 조건을 아주 잘 맞추어 실험해야 하고 나온 결과를 100% 신뢰하지는 않는다는 것을 언급해두고 싶네요.

여기에서는 그래도 RT-PCR을 소개하겠습니다. 아래 사진을 보면 total RNA의 차이가 없는 4개의 그룹에서 특정 mRNA를 타깃으로 RT-PCR을 하여 전기영동해보니 뚜렷한 차이가 있는 것을 볼 수 있습니다.

RT-PCR은 왜 하는가

RT-PCR은 이 웹페이지의 앞부분에서 설명한 바가 있으므로 여기에서는 개념만 간단히 설명하겠습니다. 위에서 total RNA의 차이를 눈으로 볼 수 없는 상황을 말씀드렸습니다. 우리가 관심있는 mRNA가 차지하는 비율이 극히 일부이기 때문입니다.

그러므로 이 mRNA를 증폭해서 그것을 눈으로 확인할 정도로 만들어 주는 것입니다. 다음 그림을 보시면 이해가 될 것으로 생각합니다.

그림에서 보듯이 total RNA는 두 그룹이 같아보이지만 실제로 증폭해서 보면 처음에 1만큼 있었던 것은 100이 된다 할 때 처음 100이 있었던 것은 10000이 되는 원리를 이용하는 것이지요.

RNA 분리와 RT-PCR 실험 과정

RNA 분리는 한번 다룬 적이 있습니다만, 여기에서 Trizol을 이용한 분리 과정을 보여드리도록 하겠습니다. 흐름상 앞의 문서를 반복시켜야 함을 양해해주시기 바랍니다.

RNA 분리의 원칙

실험을 해 보신 분들은 RNA의 명성을 익히 들어서 알고 계실 것입니다. RNA는 DNA에 비해 불안정하기도 하지만, RNA를 파괴하는 RNase라는 효소가 악질이기 때문입니다. 이 효소는 적당히 끓이는 방법으로도 제거할 수가 없으며 실험자의 손이나 여타 실험환경에도 자욱하다고 합니다. 따라서 RNA의 분리시에는 다음과 같은 원칙에 유의하면서 합니다.

1) RNase로부터 RNA를 보호한다

주위 환경의 RNase contamination 방지하기 위해서 시약에 DEPC라는 RNase inhibitor를 처리합니다. 용기는 대개 1회용을 쓰고, 어쩔 수 없는 경우 autoclave, baking 등을 이용합니다. 또 장갑을 착용하고 RNA work 만을 위한 용기를 씁니다. (깨끗하게 하면 됩니다. DEPC가 꼭 필요한 것은 아니라고 합니다.)

또한 세포가 파괴되면서 나오는 endogenous RNase를 억제해주어야 합니다. Guanidine HCl, Guanidinium thiocyanate와 같은 물질이 그 역할을 합니다. 따라서 RNA 분리를 위해서 세포를 파괴할 때는 반드시 세포가 파괴되자마자 위와 같은 용액에 노출이 될 수 있도록 해 주는 것이 대 원칙입니다.

2) 단백질을 제거한다

Phenol/Chloroform을 처리하거나 ultracentrifuge 등 여러 방법이 있습니다.

3) DNA로부터 선택적으로 RNA를 분리한다

고전적으로 쓰인 salting out이나 반복된 centrifuge로 가능하며, ultracentrifuge로 할 수도 있습니다.

RNA 분리 과정

배양세포 또는 조직을 이용해서 RNA를 분리할 수 있습니다. 어느것이나 우선 세포를 파괴시켜야 RNA를 분리할 수 있습니다. 배양세포에서 RNA를 분리하는 방법은 우선 그림과 같이 세포를 모으고 (cell harvest 라고 합니다) PBS로 washing을 거쳐 tube에 모으게 됩니다. Trizol로 분리할 때는 washing을 하지 않고 배양액을 걷어낸 후 그냥 plate에 Trizol reagent를 넣어 세포를 파괴시킨 다음 긁어서 tube에 넣게 되어있습니다.

조직을 쓰는 경우에는 이런 정도로 세포가 파괴되지 않기 때문에 세포를 갈아주어야 합니다. 이 방법들을 정리하면 다음과 같습니다.

1. 조직을 liquid nitrogen을 이용해서 동결시킨다음 막자사발에 놓고 가는 방법
    언뜻 무식해보이지만 좋은 방법입니다. 특히 대량의 샘플을 이용할 때 유용하다고 하겠습니다.
2. Glass homogenizer를 이용해서 가는 방법
    연조직일 때는 거의 이 방법을 씁니다.
3. Polytron homogenizer를 이용해서 가는 방법
    잘 갈리지 않는 조직은 칼날이 달린 이 기구를 이용해서 갈아야 할 때가 있습니다.

사진을 보여드리겠습니다. 맨 끝이 sonicator는 초음파를 이용해서 분쇄하는 것인데, 동물의 조직을 사용할 때는 잘 쓰지 않지만 파괴를 목적으로 하는 것이라 같이 보여드립니다.

이렇게 세포를 파괴한 다음 RNA를 분리하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 우선 앞에서 "원리"라고 말씀드렸던 것처럼 guanidinium thiocyanate를 처리하는 것까지는 거의 동일합니다. 그 이후에 phenol/chloroform 및 serial centrifugation을 통해 salting out하는 방법이 그 첫째입니다. 요새는 잘 안쓰는 방법입니다. 두번째는 ultracentrifuge를 이용하는 방법인데 아주 quality가 좋은 RNA를 분리할 수 있어서 실험실에서 최고급으로 사용되는 방법입니다. 세번째는 column이 포함된 kit를 사용하는 방법이 있습니다. 이 방법을 간단히 말씀드리면 세포를 부수어서 안에 있는 RNA가 용액 속에 흘러나오게 한 후 column에 결합시키고 여러 차례 column을 washing하여 protein, DNA 등 불순물을 제거하는 것입니다.

비교적 최근에 소개된 Tri-reagent(Trizol)을 이용한 방법은 실험실에 급속도로 보급되고 있는 방법입니다. 여러 회사에서 판매되고 있으며 방법이 아주 간단하고 수확율(yield)도 높은 장점이 있습니다. 대부분의 사람들에게 권해지는 방법입니다.

특정 회사의 페이지이지만 Trizol 홈페이지를 방문해보시기 바라며, 여기에 분리하는 모습을 소개하겠습니다.

원리와 과정은 위 그림과 같습니다. Trizol reagent에는 monophasic phenol이 guanidinium thiocyanate와 함께 들어있습니다. 여기에서 세포를 깬 후 chloroform 또는 BCP라는 시약을 첨가하면 비로소 층이 갈리게 되는데, RNA는 상층액에 남아있게 됩니다. 이 층을 건져 침전시키면 되는 것입니다.

Trizol reagent와 bromochloropropane (BCP)의 사진입니다. 꽤 여러 회사에서 판매합니다.

조직(100 mg)을 넣고 Trizol reagent 1 ml 넣은 다음 glass homogenizer로 가는 과정을 보이고 있습니다. 다 갈리면 저렇게 뿌연 homogenate가 되겠지요.

이를 microfuge tube에 옮기고 BCP 100 ul를 넣고 vortex, 10분 후 centrifuge하면 오른쪽 아래 그림처럼 층이 갈립니다. 여기에서 상층액을 다른 tube에 옮깁니다. 그리고 isopropanol을 500 ul 첨가한 후 잘 섞고 원심분리하면 아래와 같이 RNA가 침전된 것을 볼 수 있습니다.

이 RNA를 깨끗한 TE에 녹여서 쓰면 됩니다. 소량의 조직으로부터 상당히 high quality의 RNA가 높은 yield로 분리됩니다. 회사에서 소개하는 수확률은 다음과 같습니다.

Expected yield:
A) tissues (ug RNA/mg tissue)
    liver, spleen, 6-10 ug; kidney, 3-4 ug; skeletal muscles, brain, 1-1.5 ug; placenta, 1-4 ug
B) cultured cells (ug RNA/10⁶ cells)
    epithelial cells, 8-15 ug; fibroblasts, 5-7 ug

RT-PCR 과정은 gene cloning의 step1 : RT-PCR을 참고하시기 바랍니다.

RT-PCR의 결과

아래 그림은 제가 하는 실험 중 하나의 결과입니다. 자세한 설명은 하지 않겠지만 이렇게 특정 RNA의 양을 간접적으로나마 비교할 수 있다는 것을 보여줍니다. 각 band의 양을 densitometry로 측정하여 그래프로 나타낼 수도 있지요.

그런데 여기에서 마지막으로 설명드릴 내용이 있습니다. 위 그림에서 GAPDH는 도대체 왜 실험한 걸까요? 네 개의 그룹이 차이가 없습니다. 이런 것을 control 이라고 합니다. 우리가 실험할 때 무엇이 다르다는 것을 보여주려면 어떤 것은 같은데 이것이 다르다는 것을 상대적으로 보여주어야 합니다. 이것이 control의 의미입니다. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), actin, tubulin 등은 세포의 자극에 따라 그다지 변화하지 않는 것으로 control로 사용하기에 적당합니다. 그러나 실험 디자인에 따라 이런 molecule 들을 control로 사용할 수 없는 경우도 있으므로 정확히 공부하고 잘 선택해야 합니다. 따라서 증폭과정이 동일하게 적용되었다면 아래 그림과 같이 그룹간에 차이가 없는 것을 보여주면서 내가 관심있는 것이 다르다고 주장해야지 믿어준다는 말입니다.

공부하시느라 수고하셨습니다.
감사합니다.