앞에서 ampicillin과 LacZ를 이용한 selection 역시 4단계의 일부를 시행한 것이라고 할 수 있습니다. 여러 가지 가능성이 있는 colony 중에서 plasmid 안들어간 것들을 제거하였고, 살아남은 것들 중에서 아무런 insert가 끼어들지 않은 blue colony도 모두 제거가 되었습니다. 이제 남은 것은 뭔가가 끼어들어간 것이 분명한 clone들입니다.

과연 그것들은 내가 원하는 유전자가 들어간 것일까요? 안타깝게도 대답은 노우입니다. 나중에 DNA를 분리해서 염기서열을 분석해보면 10개 중 잘될 때는 9개, 안될 때는 전부 엉뚱한 DNA가 읽히곤 합니다.

왜 그럴까요? 내가 섞어준 것이 PCR product와 T-vector 뿐인데 왜 엉뚱한 것이 들어가있는 것일까요?

사실 이런 것은 실험을 잘 못한 결과이므로 여기서 별로 이야기할 필요는 없겠지만, gene cloning의 이해를 위해서 한번 들어두는 것도 좋을 것 같습니다.

1) 우선 PCR product가 순수한 것이 아닙니다

PCR이라는 것은 template와 primer를 넣어주고 시험관 내에서 합성하는 것입니다. 따라서 100% 순수한 것이 절대 아니며, 이것이 PCR과 gene cloning의 결정적인 차이라고 할 수도 있습니다.
PCR의 결과물에는 전기영동에서 보이는 major band 이외에 눈에 보이지 않는 수많은 minor band가 존재합니다. 단지 전기영동의 detection limit에 걸리지 못하여 보이지 않을 뿐입니다. 이런 것들이 vector와 ligation 될 수 있습니다.

그 band만 잘라서 사용했는대두요? 하고 묻는다면, 그럴 가능성이 좀 줄어들긴 합니다. 그렇지만, 우리가 칼로 자르는 부위는 실제로는 꽤 넓어서 다른 DNA가 있을 가능성이 여전히 있습니다. 더구나 여러 minor band가 바로 그 크기를 가지는 그 자리에 있다면? 설마 하겠지만 있습니다.

이런 모든 문제는 primer가 100% 원하는 target sequence에 annealing하지 못한다는 것에서 출발합니다. 항상 이런 반응은 100%가 아닌, yield의 문제라는 것을 명심하시기 바랍니다.

2) 어디선가 오염되었을 가능성이 있습니다

PCR 후 전기영동을 하고 DNA를 얻어내었다면, 전기영동시에 뭔가가 들어갔을 가능성이 생깁니다. 전기영동 탱크는 하루에도 열번 스무번 전기영동을 하는데, 그 탱크에는 씻는다고 씻어도 뭔가가 남아서 gel에 유입되는 수가 있습니다. 이런 결과로 cloning 결과로 나온 DNA가 같은 실험실에서 일하는 동료가 실험하는 DNA인, 웃지 못할 일이 가끔 벌어집니다.

그 밖에도 알 수 없는 이유로 이상한 construct들이 가끔 생깁니다. 도대체 이유를 알 수 없는 일들이지요.

그래서 이 단계가 필요합니다.

마지막 과정인 Step 4는 얻어진 colony 중에서 처음 원했던 균주를 확인하는 과정입니다. 즉, DNA 를 분리하고 염기서열을 검증하여 올바른 DNA가 분리되었는지를 확인하는 것입니다. 이미 항생제와 color selection을 통해서 대부분의 잘못된 colony가 걸러진 상태이며, 나머지 남은 colony 중에서 맞는 균주를 확인하기 위해서는 균주에서 직접 DNA를 분리하여 DNA 염기서열을 확인해보아야 합니다.

이 과정에서는 다음과 같은 것에 대한 설명이 있을 것입니다.

- Colony로부터 DNA를 분리하는 방법
- 분리한 DNA를 제한효소 지도(restriction mapping)으로 분석하는 방법
- DNA sequencing의 개념과 방법
- 올바른 균주의 보관