DNA 의 구성

여기서 DNA의 구성을 다시 review해 봅시다. DNA는 다음과 같이 phosphate group - sugar - base( purines and pyrimidines)의 세 가지 요소로 구성되는 nucleotide라는 모듈이 쌍으로 연결된 것이 이중나선 모양으로 위아래로 연결된 모양을 하고 있습니다. Phosphate group이 있는 쪽이 5' 방향, OH가 있는 쪽이 3' 방향입니다.

우리가 썼던 Taq DNA polymerase를 비롯해서 DNA polymerase는 DNA를 5'에서 3' 방향으로 합성합니다.

이런 식으로 합성이 되면 template가 끝나는 부분에서 합성이 끝나므로 blunt end인 PCR product가 형성될 것을 예상해 볼 수 있습니다. 그러나 실제로 PCR product는 예상과 다른 모습을 하고 있습니다.

PCR product의 모습은 다른 blunt end DNA와는 다른 다음과 같은 특징이 있습니다.

1) Primer의 5'쪽에는 phosphate가 없다

DNA를 SmaI과 같은 제한효소로 잘라 나오는 blunt ended DNA는 5' 쪽에 phosphate를 가지고 있습니다. DNA의 5'에는 phosphate가 당연히 있을 것으로 생각하면 대개 맞습니다.
그러나, 우리의 PCR product는 어떤가요? 아래 그림과 같이 PCR 반응 산물의 5' 끝은 우리가 넣어준 primer입니다. 이 primer의 5' 끝은 phosphate가 없습니다. Primer를 만드는 in vitro DNA synthesizer로 DNA를 합성하는 과정은 생체내에서와는 달리 3'쪽에서 5' 쪽으로 되는데, 이 과정에서 5'의 phosphate가 붙을 수 없기 때문입니다. 합성한 primer에 polynucleotide kinase라는 효소를 이용하여 5'-phosphate를 달 수는 있습니다.

2) Taq DNA polymerase는 합성이 끝난 후 3' 끝에 A를 하나 더 붙인다.

바로 위 그림과 같이 됩니다. 이것은 Taq DNA polymerase의 고유한 성질로, template가 없음에도 불구하고 A를 하나 더 붙이고 끝나는 것입니다. 이렇게 template 없이 3' 쪽에 nucleotide를 달아가는 효소를 terminal deoxynucleotidyl transferase라고 하는데, Taq DNA polymerase가 이런 activity가 있다고 보면 됩니다. 다만, 단지 한 개만 다는 것이 특징이지요.

자, 그래서 PCR product의 끝이 어떻게 생겼는지를 알았습니다. 그러면 DNA ligation을 하기 위한 vector의 끝은 어떻게 준비가 되어야 할까요? 끝이 T로 끝나는 vector를 쓰면 되겠지요? 그것이 바로 T-vector입니다.

T-vector

T-vector는 그림과 같은 모습입니다. 이렇게 되면 PCR product와 끝과 끝이 잘 맞기 때문에 ligation 될 수 있습니다.

이 T-vector는 이제 PCR product의 cloning에 너무도 많이 이용되기 때문에 고유명사가 되었습니다. 그래서 여러 회사에서 T-vector를 만들어 상품으로 나와 있습니다.

처음에 T-vector를 소개한 Nucleic Acid Research에 실린 논문에서 공개한 T-vector의 제조 방법은 위 그림에 표시한 바와 같습니다. 어떠한 vector든지 blunt end로 될 수 있는 EcoRV나 SmaI, HincII 등의 효소로 자른 다음 전기영동합니다. Gel에서 완전히 잘린 DNA 만을 정제한 다음 이 vector 5 ug에 dTTP를 final 2 mM의 고농도로 첨가하고 Taq DNA polymerase를 2시간 동안 처리합니다. Taq DNA polymerase는 dNTP mix가 존재할 경우 dATP를 가장 선호하여 끝에 붙이지만, 다른 것이 없으면 dTTP라도 끝에 붙일 수 있습니다. 이렇게 처리한 다음 다시 정제하여 ligation 반응당 10 - 25 ng씩 쓰면 됩니다.

한가지 덧붙일 말은, 이런 과정을 통해 만들기 때문에 넣어준 vector가 100% T-vector가 되는 것은 아니고 어느 정도는 blunt로 남아있을 수 있습니다. 이것은 상품으로 파는 것도 마찬가지입니다. 더구나 이렇게 만든 T-vector가 시간이 지나면 조금씩 T가 떨어질 수도 있다는 것입니다. 최근에는 XcmI이라는 효소를 이용해서 T-vector를 제조하기도 하는데, 역시 100%라고는 말 못할 것 같습니다.

DNA ligation

PCR product와 T-vector의 ligation은 다음과 같이 합니다.

다른 DNA ligation과 다를 바 없습니다.
위 그림을 보면 double stranded DNA 중에서 한 strand는 phophodiester bond가 형성될 수 있지만, primer 쪽은 phosphate가 없어서 연결되지 못합니다. 덜렁덜렁한 채로 있게 되는데, 이렇다 해도 DNA가 다시 떨어지지는 못합니다. Phosphodiester bond는 대단히 강력한 공유결합(covalent bond)이므로 효소가 없이는 떨어지지 못합니다. 이렇게 불완전하게 연결되어 있는 plasmid는 세포 속에 들어가 복제하면서 연결될 수 있기 때문에 별 문제가 안됩니다.

PCR product를 cloning하는 또다른 방법들

꼭 T-vector를 이용해야지만 PCR product를 cloning할 수 있는 것은 아닙니다. 다른 방법을 간단히 소개하면 다음과 같습니다.

1) Blunt end를 이용하는 방법

PCR product에 Klenow enzyme을 처리하면 blunt end가 됩니다. 이 효소는 DNA polymerase의 일종으로 5' to 3' polymerase 기능과 3' to 5' exonuclease 기능을 가지고 있습니다. 따라서 끝에 붙은 A를 제거해줍니다.

이것만으로는 완전치가 않아서 이 경우에는 5' phosphate를 달아주어야 합니다. 이것은 위에서 말씀드린 바와 같이 T4 polynucleotide kinase라는 효소로 할 수 있습니다. 이렇게 되어야 비로소 blunt end로 잘린 vector와 ligation이 가능해집니다.

Phosphate를 다는 과정은 반드시 필요하지만, 이렇게 blunt end가 필요한 경우에는 Taq DNA polymerase 대신에 Pfu DNA polymerase를 쓰는 것이 좋습니다. 이 효소는 Taq DNA polymerase 처럼 비교적 높은 온도에 견디지만, 끝에 A를 달지는 않습니다.

또, 이 방법으로 cloning하는 경우에는 vector를 제한효소로 잘라 blunt end로 만든 다음에 반드시 alkaline phosphatase라는 효소(보통 calf intestinal alkaline phosphatase, CIAP)를 써서 5' phosphate를 제거해주어야 합니다. 그렇지 않으면 vector가 다시 붙어 버리는, 소위 "self-ligation" 현상이 너무 많아지기 때문입니다.

2) TOPO TA cloning kit를 이용하는 방법

아주 최근에 소개된 방법이지만, 워낙 그 효율이 좋아서 많이 이용되는 방법입니다. 이 방법에서는 DNA ligase를 이용하지 않고 Vaccinia virus에서 분리한 "topoisomerase I"이라는 효소를 씁니다. 자세한 방법은 시약회사의 홈에서 구경하시기 바랍니다.

개인적인 의견으로 T-vector와는 비교가 되지 않을 정도로 성공도가 높지만, 특허가 걸려있는데다가 공급가가 너무 비싼 것이 좀 괘씸합니다.