RNA 분리의 원칙

실험을 해 보신 분들은 RNA의 명성을 익히 들어서 알고 계실 것입니다. RNA는 DNA에 비해 불안정하기도 하지만, RNA를 파괴하는 RNase라는 효소가 악질이기 때문입니다. 이 효소는 적당히 끓이는 방법으로도 제거할 수가 없으며 실험자의 손이나 여타 실험환경에도 자욱하다고 합니다. 따라서 RNA의 분리시에는 다음과 같은 원칙에 유의하면서 합니다.

1) RNase로부터 RNA를 보호한다

주위 환경의 RNase contamination 방지하기 위해서 시약에 DEPC라는 RNase inhibitor를 처리합니다. 용기는 대개 1회용을 쓰고, 어쩔 수 없는 경우 autoclave, baking 등을 이용합니다. 또 장갑을 착용하고 RNA work 만을 위한 용기를 씁니다. (깨끗하게 하면 됩니다. DEPC가 꼭 필요한 것은 아니라고 합니다.)

또한 세포가 파괴되면서 나오는 endogenous RNase를 억제해주어야 합니다. Guanidine HCl, Guanidinium thiocyanate와 같은 물질이 그 역할을 합니다. 따라서 RNA 분리를 위해서 세포를 파괴할 때는 반드시 세포가 파괴되자마자 위와 같은 용액에 노출이 될 수 있도록 해 주는 것이 대 원칙입니다.

2) 단백질을 제거한다

Phenol/Chloroform을 처리하거나 ultracentrifuge 등 여러 방법이 있습니다.

3) DNA로부터 선택적으로 RNA를 분리한다

고전적으로 쓰인 salting out이나 반복된 centrifuge로 가능하며, ultracentrifuge로 할 수도 있습니다.

RNA 분리 과정

여기서는 배양세포에서 RNA를 분리하는 방법을 소개합니다.

RNA는 세포 내에 존재하므로 가장 첫번째로 세포를 파괴시켜야 합니다. 우선 그림과 같이 세포를 모읍니다. PBS로 한번 washing하는 것은 세포의 harvest에 기본인데, RNA의 경우는 이 과정을 하지 말라는 이론도 있더군요.

그리고 다음과 같은 과정으로 거쳐서 RNA 를 분리합니다. 우선 많이 대중화되어 있는 column을 쓴 kit 방법을 소개합니다. 세포를 부수어서 안에 있는 RNA가 용액 속에 흘러나오게 한 후 column에 결합시키고 여러 차례 column을 washing하여 protein, DNA 등 불순물을 제거하는 것입니다.

이와 같은 과정은 시판되는 RNA isolation kit 를 이용하면 쉽게 할 수 있습니다.

어느 방법을 쓰나 RNA는 분리됩니다. 하지만, 자신이 가지고 있는 material이 무엇이며 양이 얼마나 되는가에 따라서 조금씩 써야 할 kit와 방법이 다를 수 있습니다.

비교적 최근에 소개된 Tri-reagent(Trizol)을 이용한 방법은 실험실에 급속도로 보급되고 있는 방법입니다. 여러 회사에서 판매되고 있으며 방법이 아주 간단하고 수확율(yield)도 높은 장점이 있습니다. 대부분의 사람들에게 권해지는 방법입니다.

특정 회사의 페이지이지만 Trizol 홈페이지를 방문해보시기 바랍니다.

Quantification of DNA and RNA

DNA나 RNA를 얻었으면 얼마나 있는가, 얼마나 정제되었는가 (다른 불순물이 없는가) 알 필요가 있을 것입니다. Spectrophotometry를 이용하여 이를 알 수 있습니다.

Spectrophotometry의 원리는 특정 파장의 빛을 액체에 통과시키면 빛의 강도가 감소하는 것입니다. 물질에 따라서, 또 파장에 따라서 빛의 강도의 감소정도가 일정하므로 이것으로 특정 물질의 농도와 다른 물질(불순물)의 농도를 알 수 있습니다. DNA와 RNA는 260 nm의 빛을 흡수합니다.

실험 결과 다음과 같이 A₂₆₀이 1 일때

ds DNA 의 농도가 50 ug/ml
ssDNA 의 농도가 33 ug/ml
RNA 의 농도가 40 ug/ml

분리한 RNA를 정량하는데 다 써버리면 실험에 사용할 RNA가 없겠지요. 실제로는 농도를 잴 때 일부만 희석하여 넣고 측정한 후 농도를 희석배율을 곱해서 계산하여 구합니다.

주된 불순물인 protein 의 농도는 A₂₈₀을 동시에 측정하여 알 수 있습니다. 일반적으로 A₂₆₀와 A₂₈₀의 비가 1.6 - 2.0 정도면 순수한 DNA나 RNA로 봅니다. 아래 그래프에서 붉은 색이 순수한 DNA 혹은 RNA의 경우이고, 녹색은 단백질이 포함된 것을 의미합니다.

아래 사진이 spectrophotometry 기계입니다. 손에 들고 있는 작은 통이 cuvette인데, 이 안에 용액을 넣어서 측정합니다.

이렇게 분리한 RNA를 이용하여 앞에서 설명한 바와 같이 reverse transcription 시킨 다음 PCR에 이용하면 되는 것입니다.